Моноклональные антитела. Получение. Использование.

Моноклональные антитела (МКА) – это иммуноглобулины, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону.Гибридо́ма — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и опухолевых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время. В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Гибридомная технология:

(1) иммунизация животных;

(2) выделение В-лимфоцитов из селезенки;

(3) культура клеток миеломы;

(4) слияние В-лимфоцитов и клеток миеломы;

(5) сегрегация (отделение) клеточных линий;

(6) скрининг и селекция линий, производящих антитела;

(7) размножениегибридомы in vitro (a) или in vivo (b);

(8) получение антител (invivo путём введения клеточной суспензии в брюшную полость мышей, где гибридома размножается подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита либо в биореакторе invitro)

Нагрузочные серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации. Компоненты. Применение.

Это реакции между антигеном и антителом, которые происходят в живом организме, а также могут быть воспроизведены в лабораторных условиях. Реакции антитела и антигена называются серологическими, или гуморальными. В процессе взаимодействия с антигеном участвует не вся молекула иммуноглобулина, а лишь ее ограниченный участок — антигенсвязывающий центр. Антитело взаимодействует не со всей молекулой антигена сразу, а только с ее антигенной детерминантой. Антитела обладают специфичностью взаимодействия, т. е. связываются со строго определенной антигенной детерминантой.

При выделении микроорганизмов от больного в бактериологических лабораториях проводят идентификацию возбудителей путем изучения их антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, содержащих специфические антитела.

В микробиологической практике широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации и т. д. Эти реакции различаются по технике постановки, хотя все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной гемагглютинацией - РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обнаружении антител - пассивной гемагглютинацией - РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В, особенно HBsAg и антител к нему.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

Наследственность и изменчивость у бактерий. Механизмы обеспечения и передачи дочерним клеткам генетической информации. Механизмы изменчивости.

У микроорганизмов, как и у других живых существ, наблюдается наследование признаков, свойственных определенному виду. В опытах было показано, что, если содержать бактерии в определенных постоянных условиях, они длительно сохраняют свои свойства. Это говорит о стабильности признаков, присущих каждому виду бактерий. Потомство микробной клетки в основном наследует ее свойства, что позволяет определить, идентифицировать, любой вид микроорганизмов. Однако известно, что у одного и того же вида бактерий возможны отклонения морфологических и физиологических свойств, возникающие под влиянием факторов внешней среды. Например, Пастер искусственным путем получил необратимые изменения у возбудителей сибирской язвы и бешенства и создал вакцины, предохраняющие от этих заболеваний. Н. Ф. Гамалея наблюдал изменения морфологии холерного вибриона при добавлении в питательную среду хлорида лития. Это свидетельствует о том, что микроорганизмы могут изменять свои свойства в зависимости от условий существования.
Сохранение определенных специфических свойств организма на протяжении ряда поколений называется наследственностью. Однако у каждого последующего поколения имеются какие-то признаки, отличающие его от предыдущего, — это изменчивость. Наследственность и изменчивость — два неразрывно связанных между собой процесса, которые являются основой всего живого.

У микроорганизмов различают фенотипическую изменчивость — ненаследуемую и генотипическую изменчивость — наследуемую, которые связаны с двумя основными особенностями клетки: ее генотипом и фенотипом. Генотип — общая сумма генов, которыми обладает клетка. Он определяет целую группу свойств организма, специфичных для данного вида микроорганизмов, которые могут по разному проявиться в различных условиях внешней среды.

Конъюгация бактерий состоит в переходе генети­ческого материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клет­ку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержа­щие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фак­тора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контро­лирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F⁺; они передают F-фактор клеткам, обозначае­мым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. highfrequencyofrecombination — высокая частота реком­бинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клет­ку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъ­югации бактерий, можно определять последовательность распо­ложения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выхо­де из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор — F'.

При конъюгации происходит только частичный перенос ге­нетического материала, поэтому ее не следует отождествлять пол­ностью с половым процессом у других организмов.

Трансдукция — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмен­та ДНК донора, и специфическую — перенос определен­ного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включе­нием ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая транс­дукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привно­сятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего про­дукта, такая трансдукция называется абортивной.

Трансформация заключа­ется в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной ра­створимой форме, передается бактерии-реципиенту. При транс­формации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий род­ственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологич­ных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмо­кокка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулен­тный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пнев­мококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пнев­мококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) дока­зали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разра­ботаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.

Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1—5 % ДНК хромосомы. Плаз­миды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интег­рировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Разли­чают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссив­ные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

Среди фенотипических признаков, сооб­щаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

1) устойчивость к антибиотикам;

2) образование колицинов;

3) продукция факторов патогенности;

4) способность к синтезу антибиотических веществ;

5) расщепление сложных органических ве­ществ;

6) образование ферментов рестрикции и модификации.

Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, напри­мер возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бак­терий использовать необычные источники углерода, контроли­ровать синтез белковых антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганиз­мов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко рас­пространены у самых разнообразных микроорганизмов.

Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетичес­кого материала, широко используются в генетической инжене­рии для получения рекомбинантных штаммов. Бла­годаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.

Неспецифические факторы защиты организма. Фагоцитоз. Показатели фагоцитоза.