Инициация репликации. Факторы инициации. Ферменты репликации.?????

Доказательства роли ДНК в передаче наследственной информации. Опыты Херши и Чейза.

Ученные Херши и Чейз провели эксперим. с бактериофагом. Они пометили радиоактивной меткой S³⁵ (изотоп серы) оболочку, и P³²( изотоп фосфора) ДНК бактериофага. Их целью было выяснить, что проникает в бактерию при заражении. Оказалось, что проникает только ДНК и на этой основе начинаеться размножение бактериофагов. Таким образом именно ДНК, а не белок определяет размножение бактериофагов в зараженных клетках.

Структура нуклеиновых кислот, Нуклеотиды их разновидности.

1869г Мишер впервые обнаружил что в ядре содержится особое вещество которое отл. От известных к тому времени и назвал его нуклеин. 1891 Косель обнаружил в нуклеине азотистые основания А Г, т е пурины.1901 он же обнаружил пиримидиновые азот основания Т Ц. 1909 Левин обнаружил в нуклеине фосфорную кислоту и рибозу , 1930 он же обнаружил дезоксирибозу. В 40-х г Кедровский и Касперсон пришли к выводу что в любых клетках как у животных т и у растений содержаться 2 нк. Одна содерж. только в ядре и ее назвали ДНК, а 2-я сод. в цитоплазме и ядре РНК.Они отличаються друг от друга тем что в РНК вместо Т – У и вместо дезоксирибозы – рибоза.Молекулярная структура ДНК впервые стала разрабатываться Чаргофом. Правила Чаргофа: 1) сумма пуриновых равна сумме пиримидиновых , т.е. А+Г=Т+Ц; 2) содержание аденина (А) равно содержанию тимина (Т), а содержание гуанина (Г) - содержанию цитозина (Ц), т.е. отношение А к Г и Г к Ц равно 1; 3) Г+Т=А+Ц, или (Г+Т)/(А+Ц)=1.

Большую роль в расшифровке строения ДНК сыграло рентгеноструктурное исследование, проведенное (1953) М. Уилкинсом и Р. Франклин. Оно показало, что ДНК - упорядоченная структура, состоящая из повторяющихся элементов, расположенных вдоль оси молекулы на расстоянии шаг спирали 34 А⁰, диаметр 20А⁰ друг от друга.

1953 г., Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, ДНК представляет собой молекулу, содержащую две полинуклеотидные цепи. Эти цепи закручены вокруг общей оси в двойную спираль, витки которой, если смотреть вдоль оси спирали, идут по часовой стрелке.

Простанственная конфигурация молекулы ДНК. Модель Уотсона и Крика. В и Z формы ДНК.

1953 г., Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, ДНК представляет собой молекулу, содержащую две полинуклеотидные цепи. Эти цепи закручены вокруг общей оси в двойную спираль, витки которой, если смотреть вдоль оси спирали, идут по часовой стрелке. Такая конфигурация ДНК называется правозакрученной и обозначается как В-форма. В результате сверхспирализации в участках В-ДНК, содержащих около 30 повторов ГЦ-пар, появляются районы левозакрученной, или Z-ДНК. Биологическое значение существования ДНК в Z-форме точно не установлено, однако показано, что Z-форма возникает в ходе кроссинговера между хромосомами в пахитене мейоза. Z-форма наименее скручена т е очень тонкая, обычно она возникает в момент раскручивания мол.ДНК. Цепи ДНК образованы последовательностью нуклеотидов, соединенных фосфодиэфирными связями, объединяющими между собой две 2-дезоксирибозы, к каждой из которых присоединено азотистое основание. Спиральная конфигурация молекулы ДНК поддерживается водородными связями между основаниями в противоположных цепях. В результате спаренные основания располагаются между двумя цепями перпендикулярно их оси. Существенный элемент модели двойной спирали - принцип комплементарности, заключающийся в том, что спаривание оснований осуществляется строго специфично: аденин всегда связывается с тимином, а цитозин- с гуанином. Комплементарность приводит к тому, что каждая пара оснований содержит по одному пурину и пиримидину.

Важная особенность структурной организации ДНК - антипараллельное расположение сахарофосфатного каркаса каждой из двух комплементарных цепей. Фосфодиэфирные связи в одной из цепей направлены от атома углерода в 5^¢-положении в дезоксирибозе одного нуклеотида к атому углерода в 3^¢-положении другого нуклеотида. В комплементарной цепи эти же связи направлены от 3^¢- к 5^¢-углероду. Такая противоположная направленность комплементарных цепей обеспечивает стабильность структуры ДНК.

Способы репликации ДНК - консервативный, полуконсервативный, дисперсионный. Опыты Мезильстона и Сталя.

В 1957 Делбруг предложил 3 модели репликации ДНК

1. Консервативная модель

Она заключаеться в том что на основе двуцепочечной мол-лы ДНК строиться другая новая дочерняя мол-ла ДНК.

2.Полуконсервативная

Согласно ей на основе старой материнской ДНК строиться 2 гибридные мол-лы которые несут 1 нить старой и 1 нить новой.

3. Дисперсионная модель

В молекуле появляется надрезы далее каждый кусок реплицируется по отдельности и дальше все собирается вместе.

Опыты Мезильстона и Сталя.

Доказательства

Впервые Мезильстон и Сталь провели эксп. на кишечной палочке. Сущность их метода заключалась в следующем: бактерии E.coli на протяжении многих генераций выращивали в среде, содержащей в качестве источника азота только его тяжелый изотоп ¹⁵N. Эта метка включалась в азотсодержащие пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, вследствие чего ДНК в клетках, выращенных среде с ¹⁵N, имела большую молекулярную массу на единицу объема (т.е. большую плотность), чем ДНК в клетках, выращенных в обычных условиях, в присутствии легкого изотопа ¹⁴N. Поэтому, если клетки после длительного выращивания на среде с ¹⁵N отмывали и переносили на время, в среду с ¹⁴N вместо ¹⁵N, то это должно было привести к появлению молекул ДНК с меньшей плотностью. Различающиеся по плотности молекулы можно разделить с помощью метода равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности 6М CsCl. ДНК распределялась по уровням в зависимости от веса. Тяжелые ¹⁵N¹⁵N на дне, ¹⁵N ¹⁴N в середине и ¹⁴N ¹⁴N на верху. Если модель консервативна то старая ¹⁴N ¹⁴N, ¹⁵N¹⁵N рис.

Если полуконсерватив. то¹⁵N¹⁴N, ¹⁴N¹⁵Nрис

 Они установили, что все модели только ¹⁵N¹⁴N, и пришли к выводу, что модель полуконсервативная. Хотя дисперсионная модель не рассматривалась.

Хеневаль подсчитал сколько у киш. палочки переплетений, и знал что репликация 15 мин. Оказалось что скорость должна быть 30тыс в мин, это биологически невозможно.

Далее появилась работа Оказаки, он доказал что при репликации ДНК образуются фрагменты 1 тыс 100 нкт и поэтому он пришел к выводу что процесс фрагментации идет дисперсно.

Направление репликации ДНК. Образование репликативной вилки. Точка ori.

 Цепи ДНК раскручив. не по всей длине, а на коротком участке, здесь образуется репликационная вилка.

Рис.

В процессе репликации ДНК образует структуры которые расплетаются и образуют ‘глаз’ 3^¢- 5^¢.В них происходит процесс репликации ДНК. Этот участок наз. репликон одна нить направлена 3^¢- 5^¢ другая 5^{¢ -} 3^¢ .В начале репликона находиться участок кот наз точка oriс этой точки начинается процесс репликации.Раскручивание репликона осущ. особыми ферментами ДНК гидразами или топоизомеразами. В результате чего спираль уходит на границы репликона, где упаковка ДНК происходит очень плотно, образуется суперспираль, это напряжение сбрасывается  с пом ферментов ДНК свейвилаз, они способны надрезать мол – лу ДНК в области фосфатного мостика,и образ шарнир Кэрнса, через него сбрасывается спиральность и напряжение исчезает. Для того чтобы нити ДНК не сливались вместе особые белки хеликазы или SSB белки соед. с одноцепочечной мол-лой и препятствуют слиянию. Начало репликона связано с особым ферментным комплексомпраймосомойв нее входят 3 фермента- 1. ДНК – праймаза, 2. ДНК зависимая рибонуклеозид трансфераза илиDNA-B белок, 3. ДНК зависимая АТФ-аза. DNA-B белок определяет место с которого праймаза начинает синтез мол – лы РНК так наз < затравку> или праймер, она всегда синтезируеться в направлении 5^{¢ -} 3 (на нити 3^¢- 5^¢ ) К концу затравки присоед фермент ДНК- полимераза III она осуществляет рост новой цепи (это наз элонгация), после того как ДНК- полимераза III доходит до конца репликона и формируется фрагмент Оказаки, фермент РНК-аза уничтожает затравку и образовавшуюся брешь достраивает ДНК – полимераза I, образовавшиеся 2 фрагмента сшиваются при пом фермента – лигазы. Если участок 3^¢- 5^¢ застраивается 2-ой нитью постоянно сдвигаясь к след. репликону его назлидирующим,противоположный формируется отдельн. фрагментами – запаздывающая.Образовавш. фрагменты сшиваются лигазой.После завершения процесса репликации в репликоне фермент топойзомераза III вместе с W белком восстанавливает спираль мол-лы ДНК.

Инициация репликации. Факторы инициации. Ферменты репликации.?????

Механизм осуществления основных этапов репликации ДНК – инициация. Инициация репликации происходит в локусе ori и начинается с появления  - репликативной вилки, образование которой связано с раскручиванием ДНК разделением ее цепей. Продвижению репликативной вилки вдоль каждой из цепей ДНК предшествуют стабилизация ее расплетенной сверхскрученной структуры ферментом SSB связывающимся с однонитевой ДНК, и появление затравки, к 3¢ОН-концу которого начинают присоединяться последующие нуклеотиды. Для ДНК полимеразы I в системе in vitro такой затравкой служит предшествующая цепь ДНК. Однако in vivo во всех исследованных случаях подобной затравкой служит не ДНК, а сравнительно короткая РНК, синтез которой осуществляется РНК-полимеразой, либо особым ферментом “праймазой”.Образующиеся на коротком участке между ДНК матрицей и РНК затравкой короткие участки обеспечивают, возможность следующего за инициацией этапа синтеза ДНК - элонгации ее цепей в направлении 5¢-3¢, осуществляемой от 3¢ОН-конца РНК затравки ДНК-полимеразой III. Позднее РНК-затравка удаляется, и в освободившийся участок встраиваются нуклеотиды, комплементарные ДНК-матрице. Сшивание этой ДНК, осуществляет ДНК-лигаза. Две цепи ДНК антипараллельны, синтез комплементарных им нитей в одном случае идет в направлении 5¢-3¢, а в другом - в 3¢-5¢. Первая нить называется лидирующей, вторая- запаздывающей. ДНК-полимеразы нуждаются в свободном 3¢ОН-конце, к которому они присоединяют нуклеотиды. В результате происходит рост цепи ДНК в направлении 5¢-3¢. Синтез 3¢-5¢-цепей носит прерывистый характер. Он осуществляется комплексом ферментов, называемым праймосомой. в нее входят 3 фермента- 1. ДНК – праймаза, 2. ДНК зависимая рибонуклеозид трансфераза илиDNA-B белок, 3. ДНК зависимая АТФ-аза (N^’белок).

Ферменты репликации

В репликации ДНК участвуют ряд ферментов. Важнейшие из них: ДНК-топоизомеразы, обеспечивающие расплетание ДНК, необходимое для инициации ее репликации и образование одиночных цепей, служащих матрицами для вновь синтезируемых дочерних молекул. Расплетенная молекула под действием фермента ДНК-гиразы образует сверхскрученную форму, напряжение сбрасывается  с пом ферментов ДНК свейвилаз, они способны надрезать мол – лу ДНК в области фосфатного мостика,и образ шарнир Кэрнса, через него сбрасывается спиральность и напряжение исчезает. ДНК-полимеразы, катализирующие добавление нуклеотидов к 3¢ОН концу цепи ДНК. ДНК-лигазы, сшивающие сахарофосфатный конец молекулы.

Факторы инициации

(Транскрипция) В состав РНК полимеразы входит d (сигма– фактор),он всегда различен и зависит от того гена экспрессию которого он вызывает в данный момент. Он определяет способность РНК-полимеразы распознавать начало данного гена и присоединяться к специфическому для каждого гена сайту инициации транскрипции, или промотору.

Есть промоторы, с которых РНК-полимераза не может начать транскрипцию без помощи специальных факторов это САР, или CRP факторы

(Терминация)

Ро фактор – особый белок повышающий точность терминации, он присоединяется к растущей цепи и РНК и передвигается вместе с РНК- полимеразой, в тот момент когда РНК- полимераза останавливается на терминирующем кодоне ро- фактор захватывает РНК и сбрасывает ее с молекулы ДНК