СИНТЕЗ НИКОТИНАМИДДИНУКЛЕОТИДА

Микробиологический синтез никотинамиддинуклеотида (НАД) происходит путем культивирования Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 с предшественником. Выращивание продуцента рекомендуется проводить на средах, содержащих глюкозу, мочевину, дрожжевой экстракт, фосфаты, соли магния, кальция и биотин. Предшественниками НАД в среде могут быть никотиновая кислота и никотинамид. В условиях опыта предшественники обычно вводят на вторые сутки роста культуры (рис. 17.2). К пятым суткам в среде накапливается НАД, и культура вступает в фазу стационарного роста. Помимо НАД, в среде содержится промежуточный продукт его синтеза - мононуклеотид никотиновой кислоты. Никотиновая кислота включается непосредственно в синтез, и если в среду вводят ее амид, происходит ферментативное дезаминирование с образованием кислоты. Ниже дана схема синтеза НАД, где фосфорибозилпирофосфат обозначен буквами ФРФФ, а остатки фосфорной кислоты в нуклеотидах - Ф (рис. ). На этой же схеме показана также реакция, в результате которой образуется никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ). Реакцию осуществляет НАД-киназа, передающая фосфорный остаток от АТФ на НАД. Для получения НАДФ предложена также система, использующая в качестве ферментного препарата экстракт из клеток Proteus mirabilis IFO 3849, а компонентами служат НАД, п-нитрофенилфосфат, никотинамид, сульфат цинка, ацетатный буфер (рН 4,0). Однако в данном случае, помимо НАДФ, происходит синтез НАД-дифосфата и некоторых НАД-аналогов.

СИНТЕЗ ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Инозиновая кислота - метаболический предшественник важнейших пуриновых нуклеотидов - адениловой и гуаниловой кислот. Поэтому накопление инозиновой кислоты может происходить, если продуцент имеет блок в ферментных системах, осуществляющих дальнейшие ее превращения.

Очевидно, что не следует лишать структуру столь необходимых и важных метаболитов (адениловой и гуаниловой кислот). Введение их в среду для восполнения дефицита возможно, но довольно дорого. Поэтому предпочитают вводить в сферу реакции нуклеозид - инозин. Для получения 5'-инозиновой кислоты (5'-ИМФ) необходимо иметь источник фермента, фосфорилирующего инозин в 5'-положении рибозного остатка. Источниками фосфорилирующего фермента - нуклеозиддифосфаттрансферазы - могут служить многие микроорганизмы, относящиеся к родам Flavobacterium, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas. Донорами фосфора в этой реакции могут быть нуклеотиды, а также неприродные соединения - п-нитрофенилфосфат (п-НФФ), бензилфосфат, фенилфосфат.

В СССР в качестве источника фосфорилирующего фермента предложен штамм Pseudomonas. Культуру предварительно выращивают на среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт. В качестве ферментного препарата, осуществляющего реакцию, используют живые клетки, высушенные под вакуумом или ацетоном, а также замороженные клетки, поскольку локализация фермента внутриклеточная. Из названных выше доноров фосфата лучшим считается п-нитрофенилфосфат. Реакция происходит в ацетатном буфере, при рН 4,0, в присутствии ионов меди и цинка, заметно усиливающих выход продукта.

Наиболее важными факторами, определяющими активность реакции фосфорилирования инозина, являются концентрации донора (фосфора), акцептора (инозина) и количества клеток. При оптимальных соотношениях п-НФФ и инозина клетки Ps. trifolii могут фосфорилировать до 90% инозина в реакционной смеси. Выход инозиновой кислоты можно увеличить, если к реакционной смеси добавить поверхностно-активные вещества, в частности различные твины. Концентрации добавок подбирают опытным путем.

Как и во всех других случаях использования в качестве ферментных препаратов клеток микроорганизмов, возникает необходимость оценить активность и условия ее проявления у ферментов, разрушающих целевой продукт синтеза. Наиболее нежелательно для синтеза инозиновой кислоты наличие активных фосфомоноэстеразы и 5'-нуклеотидазы. Если невозможно подавить их активность ингибиторами, то следует выбрать условия, при которых она будет минимальной. В первую очередь к условиям, наиболее легко регулируемым, относятся температура и рН среды. Инозиновую кислоту выделяют в виде бариевой соли и путем ионообменной хроматографии.

СИНТЕЗ ГУАНОЗИНПОЛИФОСФАТОВ

Среди продуктов обмена веществ нуклеотидной природы у микроорганизмов обнаружены гуанозинполифосфаты. Преимущественно это тетра- или пентафосфаты. Они выполняют функции регуляторов в многочисленных биохимических реакциях, поэтому на их получение обращено внимание многих специалистов.

Накопление гуанозинполифосфатов обнаружено в культуре Brevibacterium ammoniagenes KV 13510 в присутствии в реакционной смеси гуанозин-5'-монофосфата (Г-5'-Ф) или ксантозин-5'-монофосфата (Кс-5'-Ф). Штамм представляет собой мутант, требующий для выращивания присутствия в среде дорогостоящих для промышленного производства компонентов: дрожжевой экстракт, биотин, тиамин, пантотеновую кислоту и др.

Ксантозин-5'-монофосфат - метаболический предшественник гуаниловой кислоты, образующейся после амидирования пуринового основания глутаминов в присутствии АТФ.

Собственно процесс ферментативного превращения метаболических предшественников (Г-5'-Ф или Кс-5'-Ф) в нуклеозидполифосфат происходит в среде, содержащей глюкозу, а также высокий уровень фосфатов и магния. Помимо полифосфатов в среде накапливается 5'-ГМФ, 5'-ГДФ, 5'-ГТФ, однако гуанозин полифосфаты образуются в более узком интервале рН и при ином температурном оптимуме.

Фермент АТФ нуклеотид пирофосфаттрансфераза, осуществляющий перенос пирофосфатных остатков из АТФ на акцепторные молекулы, выделен из Streptomyces adephospholyticus А-4668. Продуктами реакции могут быть нуклеозид-3'-дифосфат-5'-моно(ди- и три-) фосфаты, такие, как pppGpp, ppGpp, pGpp, а также производные аденина и инозина — рррАрр, ррАрр, pppIpp.