ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ

В своей практической деятельности человек использует ферментативную активность микроорганизмов очень давно. Культуры грибов уже несколько тысяч лет назад в Китае, Корее, Японии и некоторых других странах применяли для осахаривания крахмалистых продуктов и для получения спирта.

Винокурение, хлебопечение, обработка волокнистых растений, получение кисломолочных продувов известны человечеству с давних времен. Однако использование не ферментной активности микроорганизмов, а собственно ферментов как индивидуальных химических соединений специфического и сложного строения началось сравнительно недавно. Ферменты в промышленных масштабах производятся в ССС, Японии, США, Англии, Франции, Голландии, Дании, Швейцарии, Чехословакии, Венгрии, Польше и ряде других стран.

Основными поставщиками ферментов из микроорганизмов до последнего времени были грибы. Однако сейчас все более широкое применение находят ферменты и некоторых бактерий (табл. 18.1).

Согласно принятой системе классификации все ферменты подразделяют на шесть классов. 1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтетазы).

Наиболее широкое применение получили ферменты микроорганизмов, относящиеся в гидролазам (гликозидазы, пептидазы и др.). Они воздействуют на глюкозидные, пептидные, эфирные и некоторые другие связи с участием воды:

XY+HOH→XH+YOH

Среди гидролаз много внеклеточных ферментов. Выделяясь из клеток, они накапливаются в культуральной среде. Получение таких ферментов, как уже отмечалось, проще и дешевле, чем выделение из клеток. Поэтому гидролазы представляют особый интерес и наиболее часто используются.

Гликозидазы

К гликозидазам относится большое число микробных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных соединений. Изучаются и применяются они давно. В эту группу входят амилолитические ферменты, гидролизующие крахмал: α- и β-амилазы и глюкоамилаза. Эти гидролазы в зависимости от происхождения (животные, растения, грибы, бактерии) различаются по строению, молекулярным массам, термостабильности, оптимуму рН и другим свойствам. Многие микроорганизмы образуют α-амилазу (1,4-α-D-глюканглюканогидролазу), гидролизующую внутренние α-1,4-глюкозидные связи в амилазе и амилопектине с образованием мальтозы, декстранов и небольшого количества глюкозы. Синтез β-амилазы у микроорганизмов наблюдается реже.

Продуцентами α-амилазы, применяемыми в практических целях, являются Bacillus licheniformis, Вас. amyloliquefaciens, Aspergiellus oryzae и некоторые другие микроорганизмы. Интересен тот факт, что α-амилаза Вас. licheniformis обладает очень высокой термоустойчивостью и способна гидролизовать крахмал при температуре около 100°С.

Широко представлена, в основном у грибов, глюкоамилаза (1,4- α-D-глюкан-глюканогидролаза). У Asp. niger она состоит из двух глюкопротеинов с молекулярной массой около 100000 дальтон.

Декстраназа (1,6- α-D-глюкан-глюканогидролаза) воздействует на 1,6-глюкозидные связи в декстране. В большом количестве ее образуют Penicillium purpurogenium и некоторые другие грибы этого рода.

Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогидролаза) гидролизует грибной полисахарид пуллулан, а также гликоген, аминопектин и декстрины, последние образуются из амилопектина и гликогена. Интересно, что фермент пуллуланаза получают из грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, редко используемой в качестве продуцента ферментов.

Лактаза или β-галактозидаза (β -D-галактозид-галактогидролаза) превращает лактазу в глюкозу и галактозу. Продуцируют фермент Е. coli, Asp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Curvularia inaqualis, Alternaria tenuis и некоторые другие микроорганизмы.

Инвертаза (β-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Образуют ее многие представители рода Aspergillus (Asp. awamori, Asp. batatae, Asp. niger), дрожжи, а также отдельные штаммы Bacillus subtilis и Вас. diastaticus.

Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) - сложный комплекс активных белков, действующих на различные участки молекул целлюлозы. С₁-компонент (экзонуклеаза) действует на нативную целлюлозу (хлопок, фильтровальная бумага); С_x-компонент (эндонуклеаза) гидролизует клетчатку, переведенную в растворимую форму (карбоксиметилцеллюлозу). Вместе с целлюлазами микроорганизмы продуцируют целлобиазу (β-глюкозидаза), гидролизующую целлобиозу, и гемицеллюлазу, действующую на гемицеллюлозу. В конечном счете гидролиз целлюлозы приводит к образованию глюкозы.

Выпускаемые промышленностью препараты целлюлолитических ферментов обычно обладают активностью С, и С_x, а также целлобиазной и гемицеллюлазной активностями; эти препараты стабильны в широком диапазоне рН (от 3,0 до 8,0). Продуцентами целлюлаз являются многие мицелиальные грибы, в том числе Penicillium notatum, P. variabile, P. iriense, Trichoderma roseum, Verticillium alboatrum и др. Продуцируют целлюлазы и некоторые бактерии, но их свойства изучены мало.

Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Пектины (полигалактурониды) состоят из остатков D-галактуроновых кислот, соединенных α-1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом.

Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Пектиназы (полигалактуроназы) широко распространены у микроорганизмов (грибов и бактерий); у растений они встречаются редко.

Известны ферменты, осуществляющие негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между С₄ и C₅. Грибные пектолитические ферменты имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0; они более стабильны. Некоторые фитопатогенные грибы обладают высокоактивным пектолитическим комплексом ферментов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum forma lycopersici), обусловливающим их патогенность. Фитопатогенные виды Erwinia вызывают распад тканей ряда растений благодаря высокой активности пектинолитических ферментов.

Анаэробная бактерия Clostridium felsineum продуцирует пектатрансэлиминазу, полигалактуроназу и пектинэстеразу. Четыре пектинолитических фермента обнаружены у факультативного анаэроба Bacillus polymyxa. Они характеризуются различными значениями оптимума рН и дают различные продукты гидролиза.

Протеиназы

Протеиназы, или протеазы (пептид-пептид-гидролазы), катализируют разрыв пептидных связей белков с образованием свободных аминокислот, ди- и полипептидов. Таких ферментов очень много. Некоторые из них получены в кристаллическом состоянии. По своим свойствам протеиназы микрорганизмов могут существенно различаться. Они бывают нейтральными (у Вас. subtilis, Asp. terricola), кислыми (Asp. foetidus) и щелочными, т. е. активными при различных значениях рН.

Некоторые микроорганизмы обладают несколькими протеиназами. Так, Actinomyces fradiae синтезирует шесть протеиназ. Полученный при использовании этого микроорганизма ферментный препарат «протофрадин» содержит лейцинамино- и карбоксипептидазы, сериновые протеиназы с трипсиновой, химотрипсиновой и эластазной активностями. Из культуральной среды Act. rimosus выделен комплекс протеиназ, названный «римопротелином», а из Streptomyces griseus - «протелин», гидролизующий казеин, эластин, обладающий трипсиновой, химотрипсиновой активностями и сходный с проназой.

Из Asp. terricola получен активный препарат протеиназы, лизирующий тромбы крови без гемолиза эритроцитов.

Одним из протеолитических ферментов, получаемых в промышленных количествах, является коллагеназа Clostridium histolyticum. Субстратом коллагеназы служат коллаген-белковая основа коллагеновых волокон соединительной ткани (сухожилия, сетчатый слой кожи, хрящи, связки). Пепсин, химотрипсин, трипсин, проназа отщепляют концевые пептидные группы коллагена, но не действуют на нативный коллаген.

Коллагеназа Cl. histolitycum действует на коллагены различного происхождения (шкуры животных, плавательные пузыри рыб и др.) с образованием различных продуктов, преимущественно пептидов с молекулярной массой около 500. Два трипептида доминируют в продуктах гидролиза: глицил-пролил-аланин и глицил-гистидин-пролин. Ряд грибов и Вас. subtilis образуют протеиназы, похожие на ренин животных.

Аспартаза (L-аспартат-NH₃-лиаза) осуществляет разложение аспарагиновой кислоты и активно проводит ее синтез из фумаровой кислоты и аммиака. Продуцируют этот фермент Е. coli и ряд других бактерий.

Практический интерес представляют декарбоксилазы аминокислот, образуемые рядом бактерий, в частности фермент, действующий на лизин (L-лизин-карбоксилиаза).

Липазы и другие гидролазы

Из ферментов, участвующих в липидном обмене, наибольший практический интерес представляют липазы (триацилглицерол-ацилгидролазы). Продуцентами липаз, выделяемых в культуральную среду, служат многие грибы из числа Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Geotrichum, некоторые дрожжи (Candida) и бактерии (Pseudomonas). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеролов с образованием жирных кислот и глицерина.

Фосфокиназы расщепляют сложноэфирные связи между жирными кислотами, глицерином и фосфатидиловой кислотой. Они также имеют широкое распространение у микроорганизмов, особенно часто встречаются у спорообразующих бактерий рода Clostridium и Bacillus.

Пенициллинацилазы (пенициллин аминогидролазы, иначе называемые пенициллинамидазами) катализируют гидролиз пенициллина. Это имеет большое практическое значение для получения полусинтетических пенициллинов, а также инактивации антибиотика. Продуцентами ферментов являются Е. coli и некоторые другие бактерии, а также гриб Neurospora crassa. С помощью ацилаз L-аминокислот возможно разделение их на L- и D-формы, поскольку этот фермент гидролизует только ацил-L-изомер. В результате отщепления от него ацильной группы образуется L-аминокислота, которая более растворима. Продуцентами аминоациллазы, имеющими практическое значение, являются некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Аспарагиназа, образуемая в значительном количестве некоторыми штаммами Е. coli и Erwinia carotinovora, отщепляет амидную группу от аспартата, что также имеет практическое значение.

Литические ферменты

Такие ферменты способны вызывать лизис вещества клеточной стенки у многих видов бактерий и дрожжей. По действию литические ферменты микробного происхождения сходны с лизоцимом, но отличаются от него тем, что это комплекс, в состав которого могут входить α- и β-маннозидазы, глюконазы, протеиназы, амидазы, липазы, хитиназы и другие ферменты. Последовательность действия отдельных компонентов такого сложного комплекса по отношению к различным клеткам и в зависимости от продуцента различна. Протеиназы обычно действуют раньше глюконаз на клетки дрожжей, но известно, что β-1,3- и β-1,6-глюконазы Вас. subtilis лизируют дрожжевые клетки без участия протеиназ. Продуцируют литические ферменты также некоторые актиномицеты (Actinomyces griseus, Thermoactinomyces vulgaris) и бактерии из рода Pseudomonas.

Негидролитические ферменты

К негидролитическим ферментам относятся отдельные оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы, а также лигазы. Негидролитические ферменты используются в практике пока сравнительно редко.

Лактатлиазы и пектинлиазы, как уже отмечалось выше, вместе с другими ферментами осуществляют разложение пектиновых веществ. Продуцируют их бактерии родов Erwinia, Bacillus, Clostridium, а также представители некоторых грибов рода Aspergillus.

Фумарат-гидратаза, или фумараза (L-малат-гидро-лиаза), образуемая многими микроорганизмами, катализирует образование малата из фумарата и H₂O. К числу бактерий, активно осуществляющих такую реакцию, относится Е. coli.

Изомеразы превращают глюкозу во фруктозу и ксилозу в ксилулозу. Продуцентами глюкозоизомеразы являются некоторые бактерии (Streptomyces и Bacillus), а также грибы из рода Мuсоr. Фермент используется для получения смеси D-глюкозы и фруктозы как заменителя сахарозы при гидролизе крахмала до глюкозы.

Глюкозооксидаза (β-D-глюкозо:O₂-оксидоредуктаза) осуществляет реакцию окисления β-D-глюкозы молекулярным кислородом с образованием D-глюконо-σ-лактона и пероксида водорода. Продуцируют фермент Penicillium vitale, P. notatim и Asp. niger.

Каталаза катализирует реакцию

2 Н₂О₂ + 2 Н₂O + О₂

Фермент образуют в большом количестве грибы рода Aspergillus и Penicillium (Р. vitale), а также некоторые дрожжи и бактерии. Помимо получаемых в производственных условиях и в промышленном масштабе, имеется ряд ферментов, пока используемых в ограниченном количестве, но некоторые из них чрезвычайно важны. К их числу относятся так называемые рестриктазы (эндонуклеазы), осуществляющие расщепление нуклеиновых кислот, и лигазы, участвующие в их синтезе. И те и другие необходимы для работ в области генетической инженерии. Продуцентами таких ферментов служат различные микроорганизмы.