ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ 

ОБ АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВАХ 

И ХИМИОПРЕПАРАТАХ

Задачи курса и его содержание. Основная задача данного курса - это ознакомление студентов с технологией ферментных препаратов микробного происхождения. Технологией ферментных препаратов может быть названа совокупность технологических приемов, осуществление которых на соответствующем оборудовании при наличии необходимых исходных материалов обеспечивает получение ферментных препаратов заданных свойств.

Во вводной части курса кратко изложены история возникновения и перспективы развития отрасли, основы номенклатуры выпускаемых в России ферментных препаратов, сведения об основных источниках получения ферментов, о методах определения активности, об условных единицах активности, с помощью которых выражается производительность предприятий.

В первой части детально описываются основные технологические приемы, используемые при поверхностном и глубинном культивировании продуцентов, а также при получении очищенных ферментных препаратов из культур микроорганизмов и животного сырья.

Часть вторая посвящена описанию некоторых особенностей получения препаратов, обладающих определенной активностью, например амилазной, протеазной, целлюлазной и т. д. Попутно в самом общем виде излагается механизм действия ферментов на субстрат, что в известной степени позволяет прогнозировать состав питательной среды и условия культивирования, а также свойства готовых ферментных препаратов и возможные направления их использования.

ТЕХНИЧЕСКАЯ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИИ

       ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕГЛАМЕНТ

Антибиотическое вещество, имеющее практическую значимость и являющееся новым препаратом, необходимо выпускать в промышленных масштабах. Поэтому при изучении продуцента и образуемого им антибиотика в лабораторных условиях подготавливается так называемый лабораторный регламент.

Лабораторный регламент - это технологический документ, завершающий лабораторные исследования по выработке метода получения антибиотика. Он служит основой для разработки промышленного регламента.

Задачей лабораторного регламента является определение оптимального метода промышленного производства антибиотического вещества.

В соответствии с «Отраслевым стандартом промышленного регламента производства химико-фармацевтического препарата» ОСТ 59.01.002.40-85 лабораторный регламент получения антибиотика должен включать следующие разделы.

1. Характеристика антибиотика. Сюда входит название антибиотика, основное назначение, краткое описание свойств препарата, описание организма, образующего антибиотик, методы определения биологической активности, условия хранения.

2. Технологическая схема производства. Отражает последовательность работ по производству антибиотика с подразделением на стадии. Технологическая схема служит основой будущей технологии промышленного получения препарата.

3. Сырье и материалы. Сообщаются требования, предъявляемые к качеству сырья и материалам, которые используются при получении антибиотика с целью его максимальных выходов и обеспечения повторяемости результатов. При этом необходимо ориентироваться на сырье и материалы, выпускаемые отечественной промышленностью.

4. Аппаратурная схема производства антибиотика. Представляют схему процесса получения антибиотика с указанием аппаратов и приборов, их конструкции, размера и других характеристик, которые могут иметь значение при производстве антибиотика.

5. Изложение технологического процесса. Отражает описание процесса получения антибиотика на основе завершенных экспериментальных результатов, выполненных в лабораторных условиях. Процесс включается в регламент в том случае, если удается получить воспроизводимые результаты как по качеству антибиотика, так и по его выходам.

Технологический процесс описывают по стадиям. Подробно указываются объемы, концентрации веществ, входящих в среду, рН среды, степень аэрации, растворители, пеногасители, условия перемешивания, продолжительность процесса развития продуцента, температура и другие показатели.

6. Отходы производства, технологические и вентиляционные выбросы в атмосферу, их использование и обезвреживание. Приводится перечень возможных отходов и выбросов в атмосферу, наличие в отходах ценных веществ и рекомендации к их использованию, наличие вредных с точки зрения загрязнения окружающей среды веществ и способы их обезвреживания.

7. Контроль производства. Указываются особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и всех коммуникаций, исправность и надежность работы мешалки и др.). Анализ качества сырья, соответствующего определенным стандартам. Режимы стерилизации сред и отдельных веществ, воздуха. Методы анализа за ходом процесса биосинтеза антибиотика и готовой продукции.

8. Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария. Приводится перечень веществ, способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, применяемые в процессе получения антибиотика, должны быть изучены с позиций техники безопасности, пожарной опасности и производственной санитарии.

9. Перечень производственных инструкций. Приводятся все инструкции, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента.

10. Технико-экономические нормативы. Выходы конечного продукта и промежуточных продуктов; удельные нормы расхода сырья и материалов, удельные нормы расхода технологических энергозатрат (пара, воды, электроэнергии, сжатого воздуха).

11. «Информационные материалы». В этом разделе должны быть указаны биологические и физико-химические свойства вещества, степень очистки. Фармакологические свойства (преимущества и особенности), сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов, сведения о патентной чистоте антибиотика и принятого метода его получения с перечислением охраняющих авторских свидетельств (патентов), сведения о вредности применяемых при получении препарата веществ и мерах предосторожности при работе с ними.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ФЕРМЕНТОВ

ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Ферменты широко используются в различных областях практической деятельности человека как биологические катализаторы. Источниками ферментов могут быть животные, растения и микроорганизмы. К настоящему времени установлено наличие более двух тысяч ферментов, а несколько сотен из них получены как индивидуальные вещества.

Микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов представляют особый интерес, поскольку их метаболизм, а, следовательно, и работа ферментных систем осуществляются с очень большой интенсивностью.

Если характеризовать суммарную интенсивность ферментных реакций по поглощению молекулярного кислорода в виде коэффициента Qo₂ (см³ O₂, потребленное одним мг сухой биомассы за один час), то для клеток печени он равен 2-5; почки – 10-20, дрожжевой клетки – 50-110; у бактерий рода Acetobacter - 1800, а у Azotobacter – 2000.

Помимо высокой интенсивности метаболизма, следует помнить об очень большой скорости прироста биомассы микроорганизмов. Это позволяет в течение коротких промежутков времени (иногда за 24-72 ч) получать такие количества сырья для выделения ферментов, которые не могут сравниться с тем, что дают растения и животные.

Важное свойство многих микроорганизмов - способность расти, используя различные дешевые субстраты, в том числе не имеющие пищевого значения (целлюлоза, углеводороды нефти, метан, метанол и др.). Некоторые субстраты, используемые микроорганизмами, токсичны для человека и животных.

Содержание отдельных ферментов в клетках микроорганизмов может быть весьма высоким. Так, количество рибулезобисфосфаткарбоксилазы у фототрофных бактерий иногда достигает 40-60% от всех растворимых белков.

Многие микроорганизмы образуют ферменты, которые в большом количестве выделяются в культуральную среду. Эти ферменты в основном принадлежат к гидролазам, расщепляющим белки, крахмал, целлюлозу, жиры и другие нерастворимые в воде вещества.

Выделение ферментных препаратов из клеток микроорганизмов и особенно из культуральной среды после их выращивания проще и экономичнее, чем из растительных и животных тканей.

Ряд ферментов обнаружены только у микроорганизмов. К таким ферментам относятся: танназа, расщепляющая дигаллат до галловой кислоты, рацемазы многих аминокислот, кератиназы, гидролизующие серусодержащие белки - кератины, входящие в состав волоса, перьев, рогов и копыт. Некоторые микроорганизмы обладают специфическими декарбоксилазами аминокислот, образуют пенициллиназу, расщепляющую пенициллин до пенициллиновой кислоты и воды.

Такой фермент, как нитрогеназа, участвующая в образовании аммиака из молекулярного азота, обнаружена лишь у бактерий, способных к фиксации N₂.

Характерной особенностью некоторых бактерий является их способность окислять неорганические субстраты: аммиак, нитриты, сульфид и другие соединения серы, а также двухвалентное железо, что связано с наличием у них особых ферментов. Ряд бактерий и водорослей синтезируют гидрогеназы, катализирующие окисление и образование молекулярного водорода.

Значительное число бактерий способны синтезировать ферменты, позволяющие им использовать метан, метанол, метилированные амины, окись углерода и другие одноуглеродные соединения в качестве субстратов для роста.

Очистка окружающей среды от ряда загрязняющих ее веществ возможна благодаря способности ферментов, образуемых микроорганизмами, разрушать компоненты пластмасс, пестициды и другие ядовитые соединения.

Способность микроорганизмов развиваться в экстремальных условиях, т. е. при низких и высоких температурах, в отсутствие молекулярного кислорода в кислых или щелочных средах, при высоких концентрациях солей, определяется часто характером их ферментов.

Психрофильные дрожжи Candida gelida имеют оптимум роста 15°С, при нагревании до 35°С они погибают: у них необратимо инактивируется только пируваткарбоксилаза. У облигатно психрофильного штамма Micrococcus cryophilus кратковременное нагревание до 25°С изменяет вторичную и третичную структуру глутамин- и пролин-тРНК-синтетаз. В результате клетки теряют способность соединять т-РНК с соответствующей аминокислотой. Некоторые псевдомонады обнаруживают активный рост при +3, +4°С, а их ферменты активны при -5, -10°С. Исключительное положение среди живых существ занимают термофильные бактерии, имеющие оптимум роста при 60-80°С и выше. Возможность развития этих бактерий при высоких температурах обусловливается термостабильностью белков. Например, экстремальный термофил Thertnus aquaticus обладает энолазой с оптимумом действия при 90°С.

Гриб Malbranchea pulchella var. sulfurica, способный расти при 45°С, выделяет в среду термостабильную протеиназу, сохраняющую активность при 73°С.

Некоторые мезофильные микроорганизмы также образуют ферменты с высокой термостабильностью, проявляющие максимальную активность при более высокой температуре, чем нужна для роста продуцента.

Необычна форма жизни галофильных микроорганизмов, рост их наблюдается даже в насыщенном растворе NaCl. Ферменты таких микроорганизмов требуют для проявления максимальной активности высоких концентраций солей. Отношения микробных ферментов к кислотности и щелочности среды во многих случаях также уникальны.

Амилолитическая активность Aspergillus niger обеспечивается двумя амилазами, из которых одна стабильна при очень низких значениях рН.

Некоторые амилазы, напротив, требуют для проявления активности резко щелочных условий. Например, амилаза Bacillus sp. проявляла максимум активности при рН 10,5. Известны бактерии, развивающиеся в щелочной среде (рН 9,0 и выше) и образующие ферменты с высоким оптимумом рН.

Большой интерес как продуценты ферментов представляют анаэробные микроорганизмы. Многие анаэробные бактерии превращают аминокислоты, пурины, пиримидины и другие субстраты путями, отличными от тех, которые известны для аэробных микроорганизмов, животных и растений.

В последние годы установлено, что среди строгих анаэробов имеются бактерии, способные расти в хемолитоавтотрофных условиях. При этом у них действуют системы ассимиляции углекислоты, не свойственные другим организмам, что обусловлено наличием особых ферментов. К числу таких автотрофов принадлежат некоторые метанобразующие, ацетатобразующие и сульфатредуцирующие бактерии.

Внимание, проявляемое к анаэробам, объясняется возможностью получения в результате их деятельности этанола, бутанола, метана, ацетата и других полезных продуктов при переработке растительных остатков и другого дешевого сырья. Культивирование анаэробов исключает необходимость аэрирования и перемешивания питательной среды; снижается возможность инфицирования, вызываемого недостаточной стерильностью воздуха. Кроме того, использование анаэробных микроорганизмов позволяет проводить процесс в больших емкостях с высоким слоем среды.

Свойством многих ферментов микробного происхождения является их индуцибельность. Так, синтез β-галактозидазы у Escherichia coli индуцируется лактозой и начинается менее чем через три минуты после ее внесения, а при удалении индуктора синтез так же быстро прекращается. Поэтому путем изменения условий культивирования можно добиться образования микроорганизмами больших количеств многих практически важных ферментов.

Известно, что ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но полученные из разных организмов, могут существенно различаться по свойствам. Примером этого может служить глутаминаза, осуществляющая дезамидирование глутамина с образованием глутаминовой кислоты. У глутаминаз, полученных из клеток Azotobacter agilis, оптимум рН = 6,0 - 7,0; из Clostridium welchii - 5,0; из Mycobacterium tuberculosis - 8,3. Хлориды ингибируют глутаминазу Pseudomonas sp., но не влияют на ее активность у Е. coli и активируют глутаминазу Cl. welchii. Аспарагиназы Е. coli и Alcaligenes euirophus различны по субстратной специфичности.

Резюмируя сказанное, следует подчеркнуть, что микроорганизмы обладают очень высокой активностью ферментативных реакций и способны осуществлять многие процессы, отсутствующие у макроорганизмов, благодаря наличию специфических ферментов.

Ферменты сходной функции у микро- и макроорганизмов могут быть различны по свойствам и у микроорганизмов иногда для проявления своей активности нуждаются в особых условиях. Поэтому изучение ферментов разных микроорганизмов - задача весьма важная.