Количественное определение гистамина в крови

МОДУЛЬ 4

ОБМЕН БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ЗАНЯТИЕ 1

Тема: Обмен белков. Переваривание белков в желудочно-кишечном тракте. Механизмы всасывания аминокислот. Гниение белков в кишечнике. Биохимический анализ желудочного сока.  

Актуальность. Обмен белков занимает ведущее место в различных превращениях веществ, характерных для всех живых организмов. Белки выполняют в организме ряд функций: пластическую, каталитическую, транспортную, сократительную, рецепторную, регуляторную, энергетическую и др. Белки и аминокислоты принимают непосредственное участие в биосинтезе биологически активных веществ: гормонов, медиаторов, биогенных аминов и др. Изучение обмена белков необходимо для выяснения особенностей их катаболизма и биосинтеза, овладения тонкими молекулярными механизмами, разрешающими понять развитие и протекание патологических процессов. По пищевой ценности белки делятся на полноценные - содержат все незаменимые аминокислоты, и неполноценные, в которых отсутствует хотя бы одна незаменимая аминокислота. Нативные белки пищи не утилизируются организмом без предыдущего расщепления в желудочно-кишечном тракте. Биологический смысл переваривания пищевых белков заключается в потере ими видовой и тканевой специфичности, преобразовании в иммунологично индифферентные аминокислоты, которые используются в дальнейшем для потребностей организма. Полного расщепления пищевых белков под действием ферментов желудка и тонкого кишечника чаще всего не происходит. Нерасщепленные пептиды и аминокислоты, которые не всосались в тонком кишечнике, поступают в толстый кишечник, попадают под действие ферментных систем микрофлоры; при этом образуются токсичные (фенол, крезол, индол, скатол и др.) и нетоксичные (спирты, оксикислоты, жирные кислоты и др.) соединения распада аминокислот. Все эти преобразования аминокислот, вызванные микроорганизмами толстого кишечника, называют «гниение белков». После всасывания токсичные вещества поступают в печень, где обезвреживаются вследствие химического связывания сульфатной или глюкуроновой кислотой с образованием нетоксичных «парных соединений», которые выделяются с мочой.

 Цель. Выучить переваривание пищевых белков под влиянием протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта. Охарактеризовать специфичность действия, механизмы активации и регуляции протеолитических ферментов; роль соляной кислоты желудочного сока; механизмы всасывания аминокислот. Рассмотреть преобразование аминокислот в толстом кишечнике, усвоить механизмы обезвреживания продуктов гниения аминокислот. Ознакомиться с методом количественного определения кислотности желудочного сока и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Роль белков в жизнедеятельности организма.

2. Нормы белка в питании. Полноценные и неполноценные белки. Заменимые, незаменимые, условно или частично заменимые аминокислоты.

3. Биологический смысл переваривания белков в желудочно-кишечном тракте.

4. Основные этапы энтерального обмена белков.

5. Протеолитические ферменты: специфичность действия, биологический смысл образования, механизмы активации и регуляции.

6. Химический состав желудочного сока. Роль HCl. Виды кислотности желудочного сока, методы определения.

7. Клинико-диагностическое значение анализа желудочного сока.

8. Факторы риска образования язвы и опухолей желудка. Диагностическое значение качественного определения молочной кислоты.

9. Механизмы всасывания аминокислот в кишечнике.

10. Химические преобразования аминокислот в толстом кишечнике.

11. Механизмы обезвреживания продуктов гниения белков в кишечнике.

12. Амины, которые образуются в кишечнике при гниении из диаминомонокарбоновых кислот, их обезвреживание.

13. Токсичные вещества, которые образуются в кишечнике при гниении из тирозина и фенилаланина, их обезвреживание.

14. Токсичные вещества, которые образуются в кишечнике при гниении из триптофана, их обезвреживание.

15. УДФГК и ФАФС: структура, роль в обезвреживании токсичных продуктов.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Экзопептидазы - это:  

2. С-концевые аминокислоты в белках отщепляют:

   А. Дипептидазы.    В. Аминопептидазы.     С. Карбоксипептидазы.  D. Химотрипсин.   Е. Пепсин.

3. При исследовании желудочного сока установлено, что содержание свободной соляной кислоты находится в пределах нормы. Какие из приведенных показателей (ммоль/л) подтверждают это.

4. Гниение белков под влиянием микрофлоры кишечника включает такие реакции:

    А. Преобразование белков до  пептидов.

    В. Преобразование сложных белков до простых.

    С. Образование аминокислот из белков.

    D. Переаминирование аминокислот.          

    Е. Дезаминирование и декарбоксилирование с последующим образова-
         нием токсичних продуктов.

5. N-концевые аминокислоты в белках отщепляют: 

6. В панкреатическом соке содержатся ферменты:

7.Какой из перечисленных ферментов активируется трипсином:

8. Пепсин расщепляет пептидные связи, образованные:

9. Пациент госпитализирован с жалобами на диарею после употребления белковой пищи. Врач предполагает нарушение переваривания белков, вследствие чего усиливается их гниение. Какое из перечисленных веществ является продуктом гниения белков в кишечнике? 

10. У больного наблюдается плохой аппетит, отрыжка. Общая кислотность желудочного сока составляет 10 ед. Такое состояние характерно для:

11. У новорожденного в желудке происходит свёртывание молока, т.е. преобразование растворимых белков молока казеинов на нерастворимые параказеины при участии ферментов и ионов кальция. Какой фермент принимает участие в этом процессе?

12. Токсичные вещества образуются в толстом кишечнике вследствие декарбоксилирования аминокислот? Какое вещество образуется из орнитина?  

13. У мужчины, 45 лет, который продолжительное время находился на растительной диете, выявлен отрицательный азотистый баланс. Какая особенность рациона является причиной этого?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Анализ желудочного сока

Задание 1. Провести количественное определение кислотности желудочного сока.

Принцип. Метод базируется на определении кислотных веществ желудочного сока при титровании раствором натрия гидроксида с использованием двух разных индикаторов: п-диметиламиноазобензена (зона перехода окраски при рН= 2,3…4,2) и фенолфталеина (зона перехода окраски при рН=8,2...10,0). По изменению окраски (от красного до оранжевого) индикатора п-диметиламиноазобензена определяется свободная соляная кислота, а по переходу окраски (от бесцветного до розового) фенолфталеина – общая кислотность желудочного сока.

Ход работы. В колбу для титрования вносят 5 мл желудочного сока; прибавляют 1-2 капли 0,5% раствора п-диметиламиноазобензена и 2 капли 0,5% фенолфталеина, титруют 0,1 моль/л натрия гидроксида до появления оранжево-красной окраски и отмечают объем щёлочи (в мл), пошедший на титрование свободной соляной кислоты (I пункт титрования). Продолжают титрование до появления лимонно-желтой окраски (II пункт титрования) и снова отмечают объем щёлочи, пошедший от начала титрования до II пункта титрования. Потом титрование продолжают до появления розовой окраски (III пункт титрования) и отмечают количество щёлочи, пошедшее на титрование от начала до III пункта титрования. За единицу кислотности желудочного сока принимают объем раствора 0,1 моль/л натрия гидроксида (в мл), пошедший на титрование 100 мл желудочного сока. Например: на титрование 5 мл желудочного сока до I титрования израсходовано 1,5 мл раствора 0,1 моль/л натрия гидроксида, тогда количество свободной соляной кислоты составляет: (1,5∙100)/5=30 (ед.).

Для расчета количества связанной соляной кислоты необходимо знать концентрацию общей соляной кислоты. Последнюю определяют на основании данных титрования. Известно, что количество щёлочи, которое необходимо израсходовать на связывание всей соляной кислоты, равняется среднему арифметическому количества щелочи, израсходованного до II и III пунктов титрования. Например, если до II пункта титрования израсходовано 2 мл, а до III - 3 мл щёлочи, то среднее арифметическое составляет 2,5 мл. Отсюда содержание общей соляной кислоты в 100 мл желудочного сока составляет: (2,5∙100)/5=50 (ед.).

Связанная с белками соляная кислота определяется разностью между количеством общей и свободной соляной кислоты: 50-30=20 (ед.).

Кроме того, III титрование служит для определения общей кислотности. Например, если на титрование 5 мл желудочного сока пошло 3 мл раствора 0,1 моль/л натрия гидроксида, то общая кислотность:(3,0∙100)/5=60 (ед.).

Задание 2. Определить наличие молочной кислоты (реакция Уффельмана).

Принцип. Метод базируется на способности молочной кислоты в присутствии феррум (III) фенолята образовывать соль феррума лактата желто-зеленого цвета.

Ход работы. Для приготовления феррум фенолята в пробирку вносят 10 мл 1% раствора фенола и прибавляют к нему 3 капли 1% раствора феррум (III) хлорида. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой - развивается фиолетовая окраска. Для проведения реакции в пробирку вносят 2-3 мл полученного реактива и прибавляют 5-6 капель исследуемого желудочного сока; изменение окраски на жёлтое-зеленое свидетельствует о наличии молочной кислоты.

Задание 3. Определить наличие крови (реакция Адлера с бензидином).

 Принцип. Реакция базируется на окислении бензидина кислородом, который образуется при разложении гидроген пероксида под действием каталазы крови, с образованием продуктов сине-зеленого цвета.

Ход работы. В пробирку вносят 5 капель нефильтрованного желудочного сока, прибавляют 5 капель свежеприготовленного 1% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте и 5 капель 3% раствора гидроген пероксида. При наличии крови в желудочном соке при стоянии появляется синяя или зеленая окраска (окисленный бензидин).

Практическое значение. Желудочный сок – почти бесцветная сильно кислая многокомпонентная жидкость: содержит воду (99,4%), в которой растворены ферменты, соляная кислота, мукоиды. Основным неорганическим компонентом является соляная кислота в свободном и связанном с протеинами состоянии. Также в состав входят хлориды, фосфаты, сульфаты, карбонаты натрия, калия, кальция и др. Среди органических соединений - белки, муцин (слизь), лизоцим, ферменты пепсин и ренин, продукты метаболизма. В желудочном соке содержится «внутренний фактор» Касла, который способствует всасыванию витамина B₁₂. Переваривание белков в значительной мере зависит от кислотности желудочного сока. При определении кислотности различают общую кислотность (сумма всех кислотореагирующих веществ), свободную и связанную соляную кислоту. В норме общая кислотность составляет 40-60 ед., содержание свободной соляной кислоты - 20-40 ед., связанной - 5-20 ед. Кислотность желудочного сока при заболеваниях желудка может быть нулевой, пониженной и повышенной. При язвенной болезни желудка или гиперацидном гастрите происходит увеличение содержания свободной НСl и общей кислотности (гиперхлоргидрия); при гипоацидном гастрите и опухолях желудка наблюдается уменьшение количества свободной НСl и общей кислотности (гипохлоргидрия); при злокачественных новообразованиях желудка, хроническом гастрите может отмечаться полное отсутствие свободной НСl и значительное снижение общей кислотности (ахлоргидрия); при злокачественном малокровии, опухолях желудка наблюдается полное отсутствие соляной кислоты и пепсина (ахилия). Вместе с нормальными составляющими в желудочном соке при ряде заболеваний могут появляться другие вещества: молочная кислота, кровь, жирные кислоты, желчные пигменты. В клинике их часто определяют с помощью специальных реакций. При ахлоргидрии вместе с молочной кислотой образуются жирные кислоты (уксусная, масляная), поскольку под влиянием микроорганизмов в желудке развиваются процессы брожения. Кровь (кровяные пигменты) может появляться в составе желудочного сока при язвах желудка. Желчные пигменты могут поступать в желудок из двенадцатиперстной кишки вследствие рефлюкса.

ЛІТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 390-395, 459-461.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 294-295, 470-477, 573-576.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 400-406.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 322-332.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 411-431.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. –  С. 460-469, 623-625.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 305-308.

8. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 174-191.

ЗАНЯТИЕ 2

Тема: Тканевой протеолиз. Катепсины. Аминокислотный пул (фонд) тканей: источники и пути использования аминокислот. Общие реакции катаболизма аминокислот. Декарбоксилирование аминокислот. Биогенные амины: образование, биологическая роль, распад. Количественное определение гистамина в крови.

Актуальность. Ежесуточно в организме распадается приблизительно 400 г белков до аминокислот и столько же синтезируется. Эти процессы в разных тканях происходят с разной скоростью. Тканевой гидролиз белков с помощью тканевых протеиназ или катепсинов необходим не только для их обновления, а также для разрушения дефектных молекул, мобилизации эндогенных белков для энергетических нужд и др. Аминокислотный пул на треть состоит из продуктов энтерального обмена и на две трети - из продуктов распада эндогенных белков. В зависимости от физиологических потребностей организма аминокислоты пула используются в биосинтезе белков и пептидов, образовании биологически активных соединений, принимают участие в энергетическом обмене. В процессах катаболизма аминокислоты подвергаются декарбоксилированию, дезаминированию, трансаминированию (общие пути превращения). Изучение указанных аспектов позволит будущим врачам рационально использовать знания об обмене белков и аминокислот для анализа многочисленных его нарушений.

Цель. Ознакомиться с тканевым протеолизом, классификацией и механизмом действия катепсинов. Выучить пути поступления и использования пула свободных аминокислот в тканях. Усвоить главные пути превращения аминокислот, детально остановиться на процессах декарбоксилирования; охарактеризовать роль биогенных аминов (γ-аминомасляной кислоты, гистамина, серотонина, дофамина, норадреналина, адреналина и др.), ферменты их образования и разрушения. Ознакомиться с методом определения гистамина в крови и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Тканевой протеолиз. Действие, свойства и классификация катепсинов.

2. Схема основных путей поступления и использования аминокислотного пула тканей. Основные классы органических соединений, образованных из аминокислот.

3. Общие пути превращения аминокислот.

4. Декарбоксилирование аминокислот; характеристика декарбоксилаз, роль витамина В₆.

5. Биогенные амины: реакции образования, роль. Механизмы обезвреживания биогенных аминов с помощью моно- и диаминооксидаз.

6. Декарбоксилирование фенилаланина и тирозина, роль аминов.

7. Декарбоксилирование гистидина, роль амина.

8. Декарбоксилирование триптофана и 5-гидрокситриптофана, роль аминов.

9. Декарбоксилирование глутамата и аспартата, роль аминов.

10. Декарбоксилирование цистеина и цистеиновой кислоты, роль аминов.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Укажите продукты реакций декарбоксилирования аминокислот.

2. При декарбоксилировании глутамата в ЦНС образуется медиатор. Назовите его.

А. Аспарагин. В. Серотонин. С. Гистамин. D.Глутатион. Е. ГАМК.

3. Укажите биологическую роль серотонина - продукта декарбоксилирования 5-окситриптофана.

 А. Ингибитор ферментов протеосинтеза.

 В. Активатор ферментов глюконеогенеза.

 С. Активатор ферментов гликолиза.

 D. Активатор ферментов липолиза.

 Е. Регулятор артериального давления и температуры тела.

4. Укажите биологическую роль биогенного амина, который образуется при декарбоксилировании глутамата.

5. Укажите биологическую роль гистамина, продукта декарбоксилирования гистидина. 

А. Активатор секреции желудочного сока.

В. Ингибитор секреции желудочного сока.

С. Активатор секреции бикарбонатов поджелудочной железой.

D. Ингибитор секреции бикарбонатов поджелудочной железой.

Е. Имеет бактерицидную активность.

6. Назовите биогенные амины, которые являются медиаторами торможения.

7. В больницу доставили ребенка, 7 лет, в состоянии аллергического шока. В крови повышена концентрация гистамина. В результате какой реакции образуется это соединение?

8. В организме человека есть пептид, в образовании которого принимает участие γ-карбоксильная группа глутаминовой кислоты. Назовите этот пептид.

9. Какой пищевой продукт следует исключить из рациона при лечении антидепрессантами-ингибиторами МАО?

А. Говядину. В. Капусту. С. Картофель. D. Твердые сыры. Е. Яблоки.

10. При декарбоксилировании какой аминокислоты образуется β-аланин?

А. Глутамата. В. Аспартата. С. Валина. D. Лейцина. Е. Гистидина.

11. Психофармакологические препараты с антидепрессантным действием тормозят окислительное дезаминирование норадреналина и серотонина в митохондриях головного мозга путем ингибирования фермента:    

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Количественное определение гистамина в крови