Правильная процедура забора капиллярной крови и источники ошибок:

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА КОАГУЛОПАТИЙ

Введение

Исследование системы гемостаза имеет большое значение для диагностики причин различных видов геморрагий, и тромбозов .Постоянный лабораторный контроль свёртывающей системы крови необходим при профилактике и в процессе лечения сердечно-сосудистых заболеваний, ишемий и инфарктов различных органов, большого числа акушерских осложнений и болезней новорожденных .

Согласно статистическим данным, в России причина смерти более, чем в 55 % случаев связана с болезнями системы кровообращения. В экономически развитых странах этот показатель ниже в 2 – 3 раза .(1)

Цель данного доклада- расскаать о современных подходах к лабораторной диагностике нарушений в системе гемокоагуляции, определение причин кровоточивости и тромбозов, о возможностях оценки степени интенсивности внутрисосудистого свертывания крови, а также о тех лабораторных показателях, которые необходимо определять при контроле за эффективностью применяемой противотромботической терапии.

Преаналитический этап

Преаналитическая стадия – общее понятие, относящееся ко всем процессам, происходящим непосредственно перед лабораторным анализом. Условия, в которых находится исследуемый образец до выполнения теста, оказывает решающее влияние на надежность и достоверность результатов теста .

· Образец крови – кровь, полученная от пациента. Это может быть венозная, артериальная или капиллярная кровь. Исследуемый образец – это материал, полученный после специальной обработки образца крови. Для коагулологических тестов исследуемым образцом может являться: цитратная кровь (для определения времени рекальцификации и активированного времени свертывания), цитратная плазма, полученная центрифугированием из цитратной венозной крови (для большинства коагуляционных тестов), капиллярная кровь (для определения протромбинового времени) .

· Цитратная кровь .

После забора кровь может быть в жидком состоянии только после добавления антикоагулянтных веществ, т.е. веществ, предотвращающих свертывание. В коагулологии таким веществом является цитрат натрия, который предотвращает свертывание за счет10 связывания ионов кальция. Другие антикоагулянты: ЭДТА, гепарин, оксалат натрия и пр. не пригодны, так как оказывают влияние на активность факторов свертывания.

Особенности забора крови:

1. Время – утром с 7 до 10 часов.

2. Место – кровь забирается из локтевой вены.

3. Антикоагулянт – цитрат натрия.

4. Способ забора – кровь для исследования забирают из локтевой вены в пластиковую пробирку, содержащую 0,109 М раствор цитрата натрия лимоннокислого 3-х замещенного (3,2% раствор 2-водной соли, или 3,8% 5,5-водной соли). Соотношение объемов крови и цитрата натрия – 9:1. Следует учитывать, что на показатели системы гемостаза оказывают также влияние следующие факторы: эмоциональные переживания (состояние стресса), положение тела пациента, характер пищи (диета), пол и возраст пациента, биоритмы (день/ночь), этнические и географические особенности, беременность, различные заболевания, лекарственные препараты. Забор крови должен быть приурочен ко времени исследования, чтобы свести до минимума время хранения проб. Рекомендуется осуществлять забор крови на исследование утром. Необязательно брать строго натощак, можно рекомендовать пациенту легкий завтрак, но без жирной пищи. Кроме того, рекомендуется осуществлять забор у пациентов, отдохнувших не менее 15 минут после незначительной физической нагрузки.

Правильная процедура забора крови и источники ошибок :

1. Наложение жгута. Цель наложения жгута при заборе крови – предотвратить обратный ток венозной крови при сохранении кровотока в капиллярах. Это значит, что давление жгута (манжеты) должно быть ниже диастолического кровяного давления, но выше давления в периферических венах. Жгут или манжета налагается не более чем на 60 секунд.

· Источник ошибок – если жгут наложен на слишком длительное время (более 3 минут) или с избыточным давлением, это может вести к локальной активации фибринолиза и, таким образом, к возрастанию активности факторов свертывания.

2. Венопункция – после дезинфекции кожи вена пунктируется. Кровь берут из локтевой вены силиконированной иглой с широким просветом (внутренний диаметр 1,0 – 0,8 – 0,6), без шприца (самотеком по стенке пробирки).

· Источники ошибок – в случае трудных вен или длительных попыток пунктирования, в пробирку попадает большое количество тканевого фактора (тромбопластина). Использование шприца для забора крови недопустимо. Если кровь брать шприцом слишком быстро, то из-за турбулентного движения крови в шприце и смешивания ее с воздухом (вспенивание) происходит активация тромбоцитов (изменение формы тромбоцитов и высвобождение тромбоцитарных факторов) и факторов свертывания. Если кровь брать медленно, то в шприце может начаться необратимое свертывание, опять же с11 активацией факторов гемостаза. В современной лабораторной практике используются системы вакуумного забора крови – вакутейнеры или вакуэты. Активация гемостаза в них предотвращается за счет моментального смешивания поступающей крови с раствором цитрата натрия.

 3. Выбрасывание первой порции крови – при прокалывании иглой вены тканевый тромбопластин попадает с током крови в пробирку, поэтому первая порция крови не годится для проведения коагулологический тестов. Кровь для гемостаза желательно брать во вторую пробирку, первую использовать, например, для биохимии.

· Источник ошибок – содержащийся в первой порции крови тканевый тромбопластин может влиять на результаты исследования.

4. Ток крови – важно убедиться, что игла находится в вене так, что ничего не препятствует свободному току крови. Кровь должна течь быстро и самотеком.

· Источники ошибок – если кровь течет слишком быстро, это может повредить тромбоциты (высвобождение тромбоцитарных факторов) или эритроциты (наступит гемолиз); если кровь течет слишком медленно, может иметь место свертывание крови с образованием как видимого, так и невидимого сгустка; если вытекает слишком мало крови, то не соблюдается соотношение кровь/цитрат, и результаты будут также неправильными.

5. Перемешивание – кровь должна быть смешана с цитратом натрия немедленно после забора. Перемешивание производится аккуратным переворачиванием закрытой пробирки не менее 3-х раз. Встряхивание недопустимо!

· Источники ошибок на данном этапе: – неправильный выбор антикоагулянта. Для исследования гемостаза подходит только цитрата натрия лимоннокислого 3-х замещенного (3,2% раствор 2-водной соли, или 3,8% 5,5-водной соли). Данный цитрат натрия обладает способностью стабилизировать лабильные факторы свертывания – V и VIII. Хранение раствора цитрата натрия допускается в течение 1 недели при температуре +2 – +8 ºС. Более длительное хранение приводит к бактериальному загрязнению и снижению концентрации цитрата. А, следовательно, к неправильному соотношению кровь – антикоагулянт и неправильному анализу.

Таблица 1. Соотношение объемов раствора цитрата натрия и крови в зависимости от показателя гематокрита

-нарушение соотношение крови и цитрата натрия. Принятое соотношение крови и цитрата 9:1 (9 частей крови и 1 часть цитрата натрия) верно лишь при нормальном гематокритном показателе в связи с тем, что раствор цитрата остается в плазме и не проникает в клетки крови. Поэтому при высоком гематокрите (свыше 70%) в плазме создается избыточная концентрация цитрата, приводящая к “ложной” гипокоагуляции (удлинение времени свертывания). При снижении гематокрита (ниже 35%), напротив, обнаруживается “ложная” гиперкоагуляция, и кровь может свернуться в пробирке еще до проведения исследования. Высокий гематокрит – физиологическая характеристика крови новорожденных, у взрослых возникает при полицитемиях (эритремиях), сердечной недостаточности. Пересчет соотношения объемов крови и цитрата позволяет избежать этой ошибки .

 – плохое или недостаточное перемешивание крови с цитратом натрия. Для предотвращения этого необходимо после заполнения пробирки кровью до требуемого объема закрыть ее крышкой и 3 раза медленно перевернуть (не встряхивая). Встряхивание может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов. В пробе, не закрытой крышкой, возрастает pH из-за потери CO2 (увеличение времени свертывания).

6. Хранение.

Стабилизированную кровь, до центрифугирования хранят при температуре +18-+25 ºС не более 45 минут. Кровь нельзя хранить во льду, так как это может привести к холодовой активации фактора VII.

7. Транспортировка.

В случае необходимости транспортировки крови ее необходимо забирать в СТАД пробирки, содержащие цитрат натрия, теофилин, аденозин, дипиридамол. Три последние вещества предотвращают активацию тромбоцитов. Это препятствует как агрегации тромбоцитов, так и высвобождению тромбоцитарных факторов в плазму крови. Транспортировка крови на большие расстояния и ее частое встряхивание искажает результаты анализа

 8. Дополнительная обработка.

 Для получения богатой или бедной тромбоцитами плазмы кровь центрифугируют .

 В большинстве случаев (определение ПВ, ТВ, АЧТВ, концентрации фибриногена, активности AT III, Протеина С и факторов свертывания, D-димеров), когда не предусматривается анализ функций тромбоцитов и определение волчаночного антикоагулянта (ВА) требуется получение бедной тромбоцитами плазмы. Бедная тромбоцитами плазма получается путем однократного центрифугирования цитратной крови при 3000 об/мин (1200- 1500g) в течение 15 минут.

Полученную таким образом плазму рекомендуется хранить при комнатной температуре +18–+25°С, если ее предполагают использовать для определения протромбинового времени и других тестов на его основе, анализа активности фактора13 VII или для исследования функций тромбоцитов, т.к. при температуре +2–+8°С происходит холодовая активация фактора VII и укорочение времени свертывания.

 Для проведения всех прочих тестов плазму хранить при температуре +2–+8°С.

Время хранения плазмы при комнатной температуре – не более 2 часов, при температуре +2–+8°С не более 4 часов.

Допускается однократное замораживание проб бедной тромбоцитами плазмы при температуре минус 20–40°С на срок до нескольких недель без значительной потери активности факторов свертывания крови. Размораживание плазмы осуществлять при температуре +37°С, повторная заморозка недопустима.

Капиллярная кровь

Капиллярная кровь как диагностический материал имеет ограниченное значение. Для большинства коагуляционных тестов капиллярная кровь является неподходящим материалом, так в этом случае возрастает риск активации свертывания и разведения пробы тканевой жидкостью. Для избежания неверных результатов капиллярная кровь может использоваться только для специально адаптированных методов, таких как – определение протромбинового времени. Определение ПВ в капиллярной крови особенно часто используется для долговременного мониторинга терапии оральными антикоагулянтами, а также для экспресс- диагностики и у детей первых месяцев жизни. В этом случае использование капиллярной крови из пальца (из пятки у новорожденных) позволяет избежать повторного травмирования и тромбирования вен, а так же затрат времени на центрифугирование крови.

Правильная процедура забора капиллярной крови и источники ошибок:

1. Пункция – осуществляется стерильным скарификатором. Палец предварительно протирают спиртом. Кровь обычно берут из боковой поверхности мякоти концевой фаланги четвертого пальца левой руки, ориентируя плоскость скарификатора перпендикулярно плоскости пальца, рассекая кожу поперек дактилоскопических линий.

2. Выбрасывание первых капель крови – первую каплю крови убирают безворсовым материалом, так как в ней содержится тромбопластин, следующие используют для анализа. 3. Ток крови – прокол должен быть достаточно глубоким, чтобы кровь текла самотеком. Кровь берется в стерильный стеклянный капилляр объемом ~ 100 мкл (например, капилляр Панченкова).

Не допускается давление и сжатие пальца. Поскольку это увеличивает поступление в капиллярную кровь тканевой жидкости, что искажает результаты анализа.

3. Забор капиллярной крови – необходимое количество крови забирается в стерильный капилляр в течение 10 секунд. При прохождении крови через поврежденную ткань активируется свертывание, длительность взятия крови является критическим показателем.

4. Перемешивание – капиллярная кровь при взятии в пробирку с цитратом должна быть перемешана во время или сразу после взятия. Капиллярную кровь следует смешивать сраствором цитрата натрия в пластиковых пробирках, например в пластиковых пробирках типа Эппендорф с крышкой, в соотношении 9:1 (9 частей капиллярной крови и 1 часть цитрата натрия). Пробирка закрывается крышкой и затем осуществляется медленное перемешивание. Для этого достаточно 3 раза перевернуть пробирку (не встряхивать).

 5. Хранение – цитратной капиллярной крови осуществляется при температуре +18-+25ºС не более 45 минут. Рекомендуется образец капиллярной крови анализировать на коагулометре сразу после забора.

Основные проблемы при работе с капиллярной кровью:

· 1.При прохождении крови через поврежденную ткань активируется свертывание.

· 2. Длительность взятия крови является критическим показателем. Кровь, вытекающая самотеком, должна быть забрана в стерильный капилляр и перенесена в пробирку с раствором цитрата натрия в течение 10 секунд.

· 3. Влияние гематокрита на результаты анализа.

Аналитический этап:

Наиболее распространенные ошибки аналитического этапа:

– многократное применение одноразовой посуды;

 – неправильное дозирование (неправильные метод дозирования, использование некалиброванных пипеточных дозаторов или стеклянных пипеток, повторное использование одноразовых наконечников для дозаторов);

– повторное использование одноразовых кювет для коагулометров;

 – неправильная температура или временной интервал инкубации при проведении тестов; – неправильное выполнение методики коагулологического анализа.

(1)