Метод молекулярной гибридизации

Цель

Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)

Принцип осуществления:

исследуемая ДНК

нагрев в щелочной среде

расплетение на две отдельные нити

закрепление одной из них на специальном фильтре

помещение этого фильтра в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом)

понижение температуры

+ - восстановление двойной спирали

– - двойная спираль не восстанавливается

Полимеразная цепная реакция

Цели

обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры

идентификация микроорганизмов

генотипирование микроорганизмов

Принцип проведения

патологический материал или штамм микроорганизма

выделение ДНК

нагрев

расплетение ДНК на две нити

добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена)

охлаждение

связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена

добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов

нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров

повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого гена

резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена

определение количества ДНК с помощью электрофореза

+ - количество ДНК увеличивается

– - количество ДНК не увеличивается