Методика измерения количественных характеристик микрообъектов.

3.4.1. Измерение поперечных размеров микрообъекта.

Это измерение проводится следующим образом:

а) поместить предметное стекло с препаратом на столик микроскопа. Передвинуть столик препаратоводителем 1-2 (рис.7) так, чтобы в поле зрения попал нужный фрагмент препарата, подлежащий измерению (например, отдельный эритроцит). Навести его изображение на резкость рукоятками 7-8 (рис. 6);

б) вставить вместо обычного окуляра измерительный окуляр 12Х и навести его шкалу на резкость. Совместить изображение измеряемого объекта со шкалой окуляра. Определить поперечный размер объекта, зная цену деления шкалы окуляра (см. п. 3.2.4).

3.4.2. Определение оптической разности хода.

Измерение дифференциальным методом (призма № 1)

Измерение оптической разности хода основано на выделении фрагментов объекта, имеющих соответствующую окраску.

Следует вначале настроить ДПП на окрашенный в определенный цвет фон и отметить отсчет р₀ на шкале микровинта рукоятки 11 (рис. 6). При этом в изображении объекта выделяются места, окрашенные в цвета, отличные от фона. Чтобы определить разность хода Ψ в выбранном месте объекта, необходимо перестроить ДПП поворотом рукоятки 11 до такого положения, при котором выбранное место примет ту же окраску, что и фон при первоначальной настройке. Произведя отсчет р₁ в этот момент настройки, можно определить искомую разность хода по формуле

                    (6)

Измерение методом полос (призма № 2).

Этот метод целесообразно применять тогда, когда поперечный размер объекта, вносящего искажения в картину интерференционных полос, мал (порядка 1/10 видимой ширины полосы или менее). Для такого объекта затруднительно применить дифференциальный метод, поскольку идентифицировать цвет в столь малой области поля зрения практически невозможно. Поэтому объект наблюдается на фоне картины полос в двойном изображении, причем так, чтобы его изображения были симметричны относительно выбранной прямой, в качестве которой можно взять середину некоторой темной полосы (см. рис. 3, а).

Малый предмет, форму которого в первом приближении можно считать овальной (например, отдельный эритроцит), воспроизводит на себе картину полос в искаженном виде, так что примерно в средней части его обозначается аналог выбранной темной полосы. Смещение l полосы можно измерить с помощью отсчета по шкале измерительного окуляра 12Х, цена деления которого определена при калибровке (см. п. 3.2.4), либо с помощью перемещения картины полос и отсчета по шкале микровинта рукоятки 11, согласно п. 3.2.5. Искомая разность хода Ψ определяется по формуле

                      (7)

Заметим, что точность измерения смещения полосы можно повысить, производя отсчет l как для «обыкновенного», так и для «необыкновенного» изображений предмета и усредняя полученные значения. Строго говоря, это следует делать всегда, иначе факт раздвоенности изображений оказывается невостребованным.

Описанный способ измерения оптической разности хода, наиболее подходящий для исследования малых квазиовальных объектов, может быть с успехом применен и для удлиненных объектов малой поперечной толщины (волокон, тонких пленок, канавок и т. п.). В этом случае удлиненный объект следует расположить под углом к системе полос, близким к 45 градусам (см. рис. 3, б). Вследствие малой поперечной толщины объекта величина смещения l может быть в данном случае измерена с бóльшей точностью, чем для малого квазиовального объекта. При прямом визуальном контроле можно измерять таким способом оптическую разность хода с точностью порядка λ/10.

Даже без применения компьютерной обработки изображений после фотографирования интерференционного изображения и измерения смещения полос с применением оптического денситометра можно повысить точность по крайней мере на порядок. Таким образом, распространенное мнение о том, что масштабы расстояний, меньших длины волны, недоступны для микроскопии, решительно опровергается именно методами волновой оптики.

Определение показателя преломления биообъектов,

находящихся в жидкой среде.

Измерение производится методом полос (призма № 2).

Настроив изображение объекта аналогично (3.4.2.), следует определить, как отличается показатель преломления исследуемого объекта от показателя преломления окружающей среды. Для этого следует установить раздвоенные изображения объекта симметрично относительно нулевой полосы (темной полосы нулевого порядка интерференции). Перемещая ДПП рукояткой 11 (см. рис 6), можно обнаружить затемнение одного из изображений.

Если наблюдается «правило дружбы», т.е. соответствующее изображение затемняется со своей стороны от нулевой полосы, то показатель преломления исследуемого объекта меньше, чем показатель преломления окружающей среды. Соответственно, при «отсутствии дружбы» картина обратная.Если измерить теперь вышеописанным способом оптическую разность хода для исследуемого объекта по отношению к окружающей среде, то она должна быть связана с его показателем преломления формулой:

 ,                  (8)

где n и n₁ – показатели преломления исследуемого объекта и окружающей среды соответственно, t – геометрическая толщина исследуемого объекта.

Заметим, что Ψ меняет знак в зависимости от соотношения между показателями преломления n и n_1. Следовательно, чтобы не совершить ошибки при последующем измерении, необходимо сначала применить «правило дружбы», описанное выше. Затем, поскольку априори неизвестны как n, так и t, следует применить метод «двух иммерсий», т.е. измерить Ψ в двух средах с различными (известными) показателями преломления n₁ и n₂. Искомый показатель преломления находят из решения системы двух уравнений:

           (9)

откуда:

      (10)

Здесь же можно определить и геометрическую толщину объекта t:

       (11)

Метод «двух иммерсий» требует аккуратности с той точки зрения, что соотношение между искомым показателем преломления и показателем преломления окружающей среды должно быть аналогичным для обеих сред, что при априори неизвестном n, вообще говоря, не выполнено.

Практическая часть.

4.1.Используемое оборудование и материалы:

а) микроскоп поляризационно-интерференционный типа BIOLAR с набором вспомогательного оборудования;

б) набор биологических микрообъектов для исследования: гистологические срезы, клеточные структуры, мазки крови и т.п. (предлагается преподавателем).

4.2. Порядок проведения исследований:

а) подготовить к работе микроскоп и препараты;

б) провести сравнительное качественное исследование микрообъектов дифференциальным и обычным (светополным) методом;

в) определить увеличение микроскопа при проводимых качественных исследованиях;

г) определить разрешение и полезное увеличение микроскопа;

д) произвести калибровку микроскопа для количественного анализа (согласно пп. 3.2.4, 3.2.5);

е) установить вместо окулярной насадки видеонасадку с Web-камерой (см. п.3.3). Получить изображение микрообъекта на экране компьютера и произвести подстройку в рамках приложения Quick Cam. Привести в соответствие характеристики изображения с данными калибровки (п. 4.2, д);

ж) выбрав соответствующие микрообъекты (по согласованию с преподавателем), сохранить необходимое количество изображений в файлах с тем, чтобы вести дальнейшую обработку изображений в рамках соответствующих программ (либо стандартных типа Photoshop, либо оригинальных, на усмотрение самих студентов);

з) определить поперечные размеры, геометрическую толщину и показатель преломления исследуемого объекта.

и) распечатать несколько типичных картин, наблюдаемых на дисплее (при выполнении заданий пп. 4.2, ж,з) и составить таблицу калибровочных и измеренных величин.

к) представить отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы.

1. Почему для ПИМ выбирается схема освещения по Кёлеру, хотя, казалось бы, при очень больших потерях светового потока более выгодна критическая схема освещения?

2. Каково главное преимущество микроскопа перед лупой, обуславливающее все трудности конструирования различных типов микроскопов?

3. Какие аберрации более существенны для объектива микроскопа, а какие – для окуляра?

4. Почему для ДПП выбрана схема Волластона?

5. Почему настройка на интерференционные полосы и на однородный цвет производится при скрещенных поляризаторе и анализаторе?

6. Полный набор возможных цветов фона и объекта заключен в пределах фазового набега 2π. В случае превышения этой величины цвета повторяются. Как определить оптическую толщину наблюдаемого объекта, если априори неизвестна величина фазового сдвига?

7. По какой причине может нарушаться однородность окраски фона при дифференциальном методе наблюдения? Пояснить смысл перемещения ДПП при настройке на однородный цвет вдоль и поперек оптической оси. Зачем нужны затенители, ограничивающие не ширину, а длину щели?

8. В описании работы предлагается методика калибровки дифференциальной ДПП по цветовой настройке. Такая методика калибровки не годится в случае использования монохроматического освещения. Как изменить ее, если мы все же хотим применять дифференциальный метод микроанализа и в этом случае?

9. Оценить ширину щелевой диафрагмы, при которой исчезает картина интерференционных полос. Почему при бóльшем увеличении микроскопа картина полос исчезает при бóльшей ширине щели?

10.Оценить предельно разрешаемый размер деталей объекта при наименьшем регистрируемом искажении интерференционных полос, равном 1/10 полосы.

11.Оценить число видимых порядков интерференции при наблюдении в белом свете (ширина спектра от 0,4 до 0,76 мкм) и при использовании интерференционного фильтра (ширина полосы пропускания 50 нм).

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.

1. Световая микроскопия в биологии. Методы: Пер. с англ./ Под ред. А. Лейси. ─ М., Мир, 1992. ─ 464 с.

2. Пантелеев В.Г., Егорова О.В., Клыкова Е.И. Компьютерная микроскопия. ─ М., Техносфера, 2005. ─ 304 с.

3. Сивухин Д.В. Общий курс физики в 5 томах. Т.4, Оптика. – М., Наука, 1980. ─ 752 с.

4. Саржевский А.М. Оптика. Полный курс. Изд. 2-е. ─ М., Едиториал УРСС, 2004. ─ 608 с.

Таблица 1.

Цена деления микрометрической шкалы окуляра 12Х для микроскопа типа BIOLAR, измеренная с помощью микрометрической плитки по п. 3.2.4.

(в зависимости от увеличения объектива)

Таблица 2.

Межполосное расстояние (в мкм) для микроскопа типа BIOLAR

(ориентировочные данные для измерения по п. 3.2.5)