Этапы транскрипции прокариот.

Транскрипция-это процесс синтеза РНК на матрице ДНК.

Принципы:

-матричность

-комплиментарность

-антипараллельность

-униполярность

Условия: ДНК матрица (одна кодогенная цепь), NTP, РНК-полимераза, АТФ, среда, ионы магния. Только для эукариот: факторы транскрипции.

1.^ Инициация транскрипции:

-РНКполимераза в состоянии холо-фермента связывается с промотором

-плавление ДНК, в результате образуется открытый двойной комплекс

-синтез небольшого фрагмента РНК, образуется открытый тройной комплекс

-сигма-фактор уходит, РНКполимераза остается в состоянии кор-фермента

2. Элонгация транскрипции: РНКполимераза продвигается по ДНК, расплетаете и наращивает цепь.

3.Терминация транскрипции. Транскрипция заканчивается на терминаторе:

--ρ-независимая. Осуществляется путем образования шпилек. На терминаторе есть последовательности, которые слева направо и наоборот читаются одинаково-это полиндромы. При их считывании образуются шпильки, которые тянут вниз и разрушают связи.

-ρ-зависимая. Происходит при участии ρ-белка. ρ-белок GTFазной активностью, расшепляется, идёт энергия на разрыв связей ДНК-РНК, ρ-белок обладает геликазной активностью в отношении дуплекса ДНК-РНК.

^ 31.Концепция оперона.

Оперон-это группа генов, чьи продукты учавствуют в общем метаболическом пути. Эти гены имеют общий промотр и терминатор. Их активность регулируется общим регуляторным сигналом. Оперон-это единица генетической регуляции. Транскриптон=оперон. Опероны бывают:

1. 
   катаболитный(биодеградирующий) - lac-оперон
2. 
   анаболитный(биосинтезирующий) - trp-оперон.

Конститутивные - постоянноработающие гены

Индуцибельные – непостоянноработающие

^ 32. Лактозный оперон Е.соli: строение и системы регуляции (негативная lac-репрессором и позитивная комплексом САР-белок/цАМФ).

В состав оперона входят гены, необходимые для расщепления лактозы до глюкозы и галактозы.

I - кодирует белок-репрессор, Р – промотор, О — оператор (связывается с б.-репрессором), Z – кодирует β-галактозидазу, У - кодир. галактозидпермеазу, А - кодир. трансацетилазу, Т — терминатор. Длина 6000 п.н.

^ Негативная регуляция: при отсутствии лактозы в клетке синтезируется активный репрессор, который представляет сложный аллостерический тетрамерный белок. Он соединяется с нуклеотидной последовательностью оператора, блокируя инициацию транскрипции в стартовой точке гена.

мол. лактозы связываются с б.-репрессором и превращает его в неактивную форму. Белок–репрессор, связанный с лактозой, не может присоединиться к оператору и не преграждает путь РНК-полимеразе.

^ Позитивная регуляция: САР-белок катализирует образование цАМФ из АТФ. Если в клетке имеется глюкоза, то САР-б., связыаясь с ней, переходит в неактивную форму. Если глюкозы нет, то происходит увеличение цАМФ, который связывается с САР-б. Последний активизируется, связывается с промотором и увеличивает скорость транскрипции.

Сильная работа оперона приотсутствии глякозы и наличии лактозы. Оперон не работает, если нет лактозы.
^ 33. Триптофановый оперон Е.coli: строение и системы регуляции (негативная trp-репрессором и регуляция в аттенюаторе).

В состав входят гены фермента, для синтеза триптофана.

P - промотор, О - оператор, At – аттенюатор (содержит полиндромные последовательности), Е, D, C, B, A – структурные гены, Т-терминатор.

^ Негативная регуляция: ген-регулятор trpR кодирует белок-апорепрессор. Он соединяется с коррепрессором — триптофаном. Этот комплекс является репрессором транскрипции.

^ Позитивная регуляция: Регуляция работы триптофанового оперона с помощью аттенуации осуществляется при участии последовательности, находящейся на расстоянии примерно 100-140 пар оснований от начала транскрипции. Этот так называемый лидерный сегмент, trpL, содержит аттенуаторную последовательность, которая вынуждает РНК-полимеразу прервать транскрипцию. При недостатке триптофана образуется нетерминаторная шпилечная структура на участке 2, которая мешает прохождению рибосомы =>оперон не работает. А при повышенном содержании триптофана образуются терминаторные шпильки на 1 и 3 участках =>оперон работает.
^ 34. Особенности транскрипции в клетках эукариот. РНК-полимеразы эукариот и их функции. Регуляторные цис-элементы и белковые транс-факторы.

Гены эукариот имеют мозаичное строение: экзоны — несут информацию о структуре полипептида, интроны — не несут.

РНК-pol эукариот представляют собой мультисубъединичный комплекс (2 большие и ≈10 малых).

Ядерные:РНК-пол 1 синтезирует 5,8S, 18S, 28S рРНК

РНК-пол 2 — большинство мРНК, мяРНК

РНК-пол 3 — тРНК, 5S рРНК

РНК-пол 4 — остальные мРНК

мтхРНК-пол — синтезирует митохондриальные гены.

Цис-элемент — участок ДНК или РНК, который регулирует экспрессию генов, локализованных на той же молекуле ДНК (хромосоме). Представляют собою места связывания с ДНК регуляторных белков.

Белковые транс-факторы: белки, взаимодействующие с ДНК и управляющие экспрессией генов.
^ 35. Особенности строения промоторов генов эукариот. Базальные факторы транскрипции и их роль в инициации транскрипции.

Промотор — участок ДНК, с которым связывается ДНК-пол, и который заканчивается точкой +1 (точка начала транскрипции).

Промотор прокариот:

3'___________________________________________5'

5'______-35___________-10____________+1_______3'

^ TTGACA TATAAT CAT

Промотор эукариот:

3'__________________________________________ 5'

5'____-300/-100_____-100/-50_____-25___+1______3'

GC GCAAT TATAA

Факторы:

ТВР-фактор (одна из субъединиц TF2D) – распознает ТАТА-бокс;

ТАFs (TBP-ассоциированный фактор) — распознает ТВР;

TF2A — привлекает белок для следующего фактора;

TF2B – имеет 3 активных центра: 1ым свызывается с предыдущим фактором, 2ым со следующим фактором, 3им с РНК-пол

TF2F – обладая геликазной аетивностью, связывается с РНК-пол

TF2E – привлекает следующий фактор

TF2H – обладая коназной активностью, фосфорилирует белок, воздействует на РНК-пол2.
36. Цис-регуляторные элементы эукариотических генов: энхансеры, сайленсеры, инсуляторы (локализация, характеристика, механизмы взаимодеиствия с промоторами генов эукариот).

Энхансер - небольшой участок ДНК, способный связываться с белками (а именно факторами транскрипции), при этом увеличивая уровень транскрипции гена или группы генов. Энхансеру необязательно находиться в непосредственной близости от генов, на которые он действует, и даже необязательно располагаться с ними на одной хромосоме. Энхансеру также нет необходимости располагаться вблизи от сайта инициации транскрипции для того, чтобы влиять на ее уровень. Непосредственное влияние на промотор энхансеры не оказывают, они действуют опосредованно через белки-активаторы. Взаимодействуя с комплексом-медиатором они активируют полимеразу II и общие факторы транскрипции, что ведет к транскрибированию генов. Энхансеры также могут находиться внутри интронов.

Сайленсер — последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полной супрессии синтеза РНК ферментом ДНК-зависимой РНК-полимерозой. Сайленсеры могут находиться на расстоянии до 2500 пар нуклеотидов от промотора.

Инсулятор - последовательности ДНК, особые регуляторные элементы, которые обладают способностью блокировать сигналы, исходящие от окружения. Эта функция инсуляторов включает две активности. Во-первых, они блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. При этом инсулятор выполняет только разделительную функцию и не влияет на активность энхансера и промотора. Во-вторых, инсулятор выполняет барьерную функцию для распространяющегося конденсированного хроматина. Показано, что существуют инсуляторы, как выполняющие одну из двух функций, так и обе.
37. Роль структуры хроматина в регуляции транскрипции генов эекариот (гетерохроматин, эухроматин). Участие малых интерферирующих РНК в подавлении транскрипции (РНК-интерференция). Метилирование как способ контроля активности генов эукариот.

Важным фактором, влияющим на прохождение промотор-проксимальной паузы, является структура хроматина в районе промотора. образование нуклеосом более чем в 100 раз увеличивает продолжительность транскрипционной паузы. Наиболее активным для транскрипции уровень укладки ДНК все же является нуклеосомный. Нуклеосома состоит из 4 пар гистонов, которые образуют её кор (ядро). Две пары димеров H2A-H2B и тетрамер из 2 пар гистонов H3 и H4. ДНК делает вокруг нуклеосомы 1.75 оборота. Минимальное количество оснований на нуклеосоме - 146. Кроме того, в организацию нуклеосомной последовательности вовлечён гистон H1. Считается, что он ассоциирован с линкерной ДНК.

РНК-интерференция — подавление активности генов с помощью молекул микроРНК: одна из цепей микроРНК комплементарна мРНК, и на концах находится по 1му неспаренному нуклеотиду. ПромикроРНК состоит из шпильки и петли. Комплекс ферментов Diser (работая как эндонуклеаза) формирует N микроРНК, которая называется малая интерферирующая РНК (siRNA). Затем комплекс ферментов Risc присоединяется к цепи микроРНК. После присоединения образовавшегося комплекса к мРНК, Risc работает как эндонуклеаза — мРНК деградирует. Если образуется не siRNA, то Risc просто блокирует транскрипцию — мРНК не деградирует.

^ Метилирование ДНК - это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК. Заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида. Участвует метил-трансфераза. Если происходит метилирование в промоторе, то происходит инактивация транскрипции.
^ 38. Процессинг пре-мРНК эукариот и его этапы (сплайсинг, модификация 3'- и 5'-концов мРНК). Роль мяРНК в сплайсинге гяРНК. Структура сплайсосомы.

1. Кэпирование. «Кэп» - метилгуанозин- присоединяется с помощью гуанилинтрансферазы 5'-5' связью к первому нуклеотиду. Последующие кэпируются с помощью метилтрансферазы. Значения: защита 5'конца от разрушения, взаимодействие с рибосомой, возможно,участие в выходе мРНК из ядра.

2. Полиаденилирование. На РНК есть сигнальная пос-ть AAUAAA. После считывания этой пос-ти через 20 нуклеотидов РНК-пол2 разрезает РНК,а polyA-полимераза присоединяет пос-ть из n числа А. Значение: защита 3' конца от разрушения, участие в выходе мРНК из ядра, возможно, участие в сплайсинге.

3. Сплайсинг — вырезание int и сшивание ex.

5'__ex1__GU______int______A__polyPd__AG_____ex2__3'

В вырезании int участвуют рибозимы (это мяРНП = мяРНК + белки). Сплайсосому составляют 5 малоядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП) и некоторое количество дополнительных белковых факторов. Содержащиеся в сплайсосоме мяРНП называются U1, U2, U4, U5 и U6. U1, находящийся на пос-ти GU, присоединяется к остальным, кот находятся на пос-ти AG. Рибозимы активируют транч-сайт А и к нему присоединяется G (из пос-ти GU). Сплаисосома активирует последний нуклеотид ex1,и он разрушает связь между int и ex2.

Зрелая мРНК:

5'G___5'UTR___AUG_____________UAG___3'UTR__AAA3'

кэп/нетрансл/старт код/рамка счит/стоп к./нетранс/polyA

^ 39. Конститутивный и альтернативный сплайсинг. Роль альтернативного сплайсинга в регуляции экспрессии генов. Аутосплайсинг рРНК Tetrahymena.

Конститутивный сплайсинг — экзоны сшиваются в разных случаях в одинаковом порядке, давая одинаковые белки. При сплайсинге большей части про-мРНК каждый интрон вырезается в соответствующих 5`-и 3`-сайтах сплайсинга. В результате все экзоны и порядок их расположения в транскрипте сохраняются в зрелой мРНК и образуют непрерывную последовательность

^ Альтернативный сплайсинг - это образование разных мРНК из одной и той же пре-мРНК, синтезированной с одного гена. Это достигается благодаря комбинированию порядка и количества экзонов. С одного и того же гена синтезируются разные белки.

Аутосплайсинг — происходит без участия какого-либо фермента, т.е. мРНК сама является катализатором этого процесса. Необходимо лишь наличие ионов Mg и нуклеотида с G, который разрывает связь между int и ex1, присоединяясь в int. Последний нуклеотид ex1 атакует связь ex2-int.
^ 40. Синтез белка в клетке (принципы и этапы трансляции). Активация АК и образование аминоацил-тРНК.

Принципы: матричность и коллинеарность (соответствие триплетов в матрице аминокис-там в белке).

Образ комплекса: 1. Активация АК: от АТР к АК присоединяется АМР вместо ОН, освобождается Р-Р.

2. Присоединение к тРНК: вместо АМР присоединяется тРНК и освобождается АМР.

В образовании участвует фермент аминоацил-тРНК-синтетаза, имеющий 3 активных центра.

Этапы трансляции:

1. Инициация. а) диссоциация рибосомы (IF1 и IF3); б) +мРНК; в) +формилметионин в Р-участок рибосомы; г) взаимодействие кодон-антикодон; д) +большая субъединица; е) сброс IF.

2. Элонгация. а)образ комплекса аминоацил-тРНК; б) его доставка в А-участок (Tu и GTP); в) образ пептидной связи (пептидил-трансфераза); г) транслокация рибосомы на 1 кодон (фактор G+GTP); д) регенерация факторов.

3. Терминация.
^ 41.Организация рибосом прокариот и эукариот (рибосомные РНК и рибосомные белки). Функциональные сайты рибосомы.

Прокариоты. 70S = малая 30S (16S pPHK и 21 белок) + большая 50s (5S, 23S pPHK и 34 белка).

Эукариоты. 80S = малая 40S (18S pPHK и ≈35 белков) + большая 60S (5S, 5,8S, 28S pPHK и ≈50 белков).

А-участок (аминоацильный) — в нем находится АК, которую необходимо присоединить к растущему полипептиду.

Р-участок (пептидильный) — в нем находится растущий полипептид.

Е-участок (exit-сайт) — через него выходит тРНК.

^ 42.Инициация трансляции. Инициирующие кодоны и инициаторные тРНК у про- и эукариот. Факторы инициации трансляции.

1. Малая субъединица (30S) + IF3 (осуществляет диссоциац) + IF1 (блокир А-центр; вспомогат для IF3) => диссоциация рибосомы.

2. +мРНК в малую субъединицу.

3. Взаимодействие комплементарных пос-тей Шайна-Дальгарно (на мРНК за 10 нуклеотидов от стартового кодона) и антиШайна-Дальгарна (на 16S pPHK) — у прокариот; или пос-ть Козак и пос-ть на 18S pPHK — у эукариот.

4. Доставка формилметионина-тРНК в Р-сайт с помощью IF2 и GTP.

*стартовая АК у прокариот — формилметионин, у эукариот — метионин (валин).

5.Взаимодействие кодона мРНК с антикодоном тРНК.

**стартовый кодон — AUG

***стартовый антикодон — UAC

6. Присоединение большой субъединицы.

7. Сброс IF.

****У эукариот IF около 15 штук.