Типы двойных спиралей ДНК (В, А, С, Z-формы ДНК). Физические свойства молекул ДНК.

А, В, С - правозакрученные

Z - левозакрученные

^ В спираль: длина одного витка 3-4 нанометра

На один виток приходится 10 пар нуклеотидов

Расстояние между соседними парами оснований 0.34 нм

Диаметр спирали 2 нанометра
^ 17. Особенности строения РНК. Типы молекул, их функции.

Первичная структура РНК - это последовательность нуклеотидов, соединенных 3'-5'фосфодиэфирными связями (-О-Р-О-)

Вторичная структура РНК - это одноцепочечные РНК (за исключение некоторых вирусных РНК и микро РНК)

Вторичная структура транспортной РНК содержит:

1.Акцепторный стебель, воспринимающий шпильки, где азотистые основания нашли пару.

2.Шпильки

3.Дигидроуридиновая петля (ДИ)

4.Псевдоуридиновая петля (ФИ)

5.Вариабельная петля на ФИ

6.Антикодон

Третичная структура РНК-это способ укладки молекулы в пространстве.

У транспортной РНК - это «L» форма.

Типы молекул РНК:

-матричная(информационная)РНК. В клетке до 5%. Длина от сотен до 1000 нуклеотидов. Функция-зашифровка информации о структуре белка.

-транспортная РНК. В клетке 10%. Длина 85-100 нуклеотидов. Функция-транспорт аминокислот, узнавание кодона матричной РНК.

-рибосомальная РНК. В клетке до 85%. Измеряется в единицах Сверберга («S»-коэффициент седиментации, оседания). Функция-структурная, образование пептидных связей.

-малоядерная РНК. Длина 250 нуклеотидов. Функция-участвует в сплайсинге.

-РНК праймеры. Длина 20 нуклеотидов. Функция-участие в репликации.

-микро РНК. Двуцепочечная молекула. Длина 21-23пары нуклеотидов. Это малые интерферирующие РНК. Функция: регулируют активность других генов.

-вирусные РНК. Может быть 1 и 2 цепочечные.
^ 18. Принципы репликации ДНК. Понятие о репликоне и репликационной вилке.

Репликация(А.Корнберг 1959г.).Принципы:

-матричность

-комплиментарность

-антипараллельность

-полуконсервативность

Условия: ДНК матрица,dNTP(рибонуклеозидтрифосфаты для праймеов), ферменты, среда (ионы магния), АТФ.

Репликон - это участок молекулы ДНК, который удваивается с первого ОРИ-сайта. Молекула ДНК прокариот-монорепликон.
^ 19. Ферменты репликации ДНК и их функции.

-геликаза: разрушает водородные связи

-топоизомеразы (I и II): снимают топологическое напряжение в сети ДНК. I-однонитевые разрывы, II-двунитевые разрывы.

-ДНК-полимеразы:

ДНК-полимераза I: может работать как полимераза-удлиняет цепь. Может как экзонуклеаза-резать нуклеотиды с 3'и 5' концов.

ДНК-полимераза II: это фермент репарации, в репликации не участвует.

ДНК-полимераза III: это основной фермент репликации. Скорость полимеразной реакции в 60 раз больше, чем у ДНК-pol I. Работает как полимераза и экзонуклеаза 3' конца.

-Праймаза: синтезирует праймеры, которые выступают в роли затравки.

- лигаза: сшивает фрагменты Оказаки.

-Гираза: закручивает в спираль.
^ 20.Механизмы синтеза ДНК в клетеах бактерий. Синтез ведущей и отстающей цепей ДНК. Фрагменты Оказаки.

Инициация:

-ORI-сайт. Место, где больше всего двойных связей, т.к. их легче разорвать (А=Т).

-инициаторные белки (сигнал к началу)

-геликаза

-топоизомеразы

-ssb-белки, которые препятствуют ренатурации молекул (образованию водородных связей). Образуется репликационный глазок.

Лидирующая цепь ДНК от 3'конца, по ней движется один праймер (по ходу раскручивания цепи).

Синтез на отстающей цепи: учавствуют несколько праймеров, которые присоединяются по ходу раскручивания цепи.

^ Синтез ДНК: основной фермент ДНК полимераза

-праймаза

-ДНК полимераза III (начало синтеза)

-ДНК полимераза I

-лигаза

-гираза

Скорость репликации у прокариот 500 нуклеотидов в секунду. Длина фрагментов Оказаки 1000-2000 нуклеотидов.
21. ПЦР.

это молекулярно-генетический метод получения в пробирке (in vitro) большого количества копий определенного фрагмента ДНК. (Полимеразно цепная реакция была открыта в 1983 г. Мюллисом.)

Смесь для ПЦР:

1. 
   «L» праймер (левый) 1микролитр
2. 
   «R» праймер (правый) 1миккролитр
3. 
   Смесь dNTP 5 микролитров
4. 
   Буферный раствор 10 микролитров
5. 
   Дистиллированная вода 22 микролитра
6. 
   ДНК матрица 10 микролитров
7. 
   Taq-полимераза 1 микролитров

Общее количество смеси 50 микролитров. Затем пробирка ставится в амплификатор на 35-40 циклов (1.5-2 часа)

1.Денатурация. Разрушение водородных связей под действием температуры. 95*, 45 сек.

2.Ренатурация. Отжиг с праймерами. Температуру понижаем до 60 градусов, 30 секунд.

3.Элонгация. 72 градуса, 1 минута

4.Детекция результатов ПЦР. Визуализация результатов. Проводится методом гель-электрофареза (горизонтального или вертикального). При горизонтальном используется гель агароза. При вертикальном полиакриламидный гель. В роли красителя-бромистый этидий.

Метод ПЦР применяется в биологических и медицинских исследования для определения фрагментов ДНК того или иного вируса или бактерии.
^ 22. Особенности синтеза ДНК в клетках эукариот.

Репликация происходит в «S» период митотического цикла, в ядре. ДНК полимеразы эукариот:

-есть фермент РНКаза H (аш)-удаляет праймеры

-скорость репликации у эукариот 50 нуклеодитов

-молекула ДНК эукариот-полирепликон, т.е. несколько ОРИ-сайтов

-длина фрагментов Оказаки 100-200 нуклеотидов

-наличие тейломеразы, которая достраивает теломерные участки хромосом.
^ 23. Генетический код и его характеристики. Современная концепция гена.

Генетический код был расшифрован полностью к 1966 году. Генетический код-это система записи последовательности аминокислот в белке в виде последовательности нуклеотидов ДНК или РНК.

Свойства генетического кода:

1.Триплетность. Комбинация из трех нуклеотидов кодирует одну аминокислоту. Всего 64 триплета, 61 значащий и 3 стоп кодона (UUA,UAG,UGA).

2.Вырожденность, избыточность. Есть аминокислоты, которые кодируются несколькими кодонами, а не одним: лейцин, серин.

3.Однозначость, спецефичность. Определенный кодон соответствует только одной аминокислоте.

4.Неперекрываемость. У соседних триплетов нет общих нуклеотидов.

5.Непрерывность. Между кодонами нет разграничителей. Все считывается подряд.

6.Универсальность. Одни и те же триплеты кодируют одни и те же аминокислоты.
^ 24. Генные (точковые) мутации.

Это мутации, возникающие в пределах одного гена.

Классификация:

-замена нуклеотидов:

а).простая – транзиция, внутриклассовая

б).сложная – трансверсия, межклассовая. В этом случае пирадмидины заменяются на пурины.

-выпадение нукл-в (не менятся рамка считывание

-вставка нук-в если кол-во нуклеотидов кратно 3)

-инверсия. Поворот на 180 градусов

^ Механизмы возникновения мутаций:

1.Ошибка ДНК полимеразы.

2.Таутомеризация азотистых оснований. Это изменение положения протона, в результате меняются свойства молекул. Есть также аналоги азотистых оснований 5-бромурацил, который может вести себя как тимин и цитозин, есть 2-аминопурин, который может вести себя как аденини и гуанин.

3.Дезаминирование. Это удаление аминогруппы (NH2). Под действием азотистой кислоты происходит отщипление от цитозина аминогруппы, и данное азотистое основание переходид в урацил. Урацил не характерен для ДНК, он образует связь с аденином, а аденин с тимином.

4.Алкилирование азотистых оснований (чаще происходит метилирование). К гуанину присоединятся мелильный радикал, и он превращается в тимин.

5.Апуринизация и апиримидинизация азотистых оснований. Происходит отщепление азотистого основания от сахарного остова. При возникновении отщепления активируется АП-сайт, распознается ферментами репарации и удаляется, но это происходит не всегда.

6.Вставки нуклеотидов вызывают интеркалирующие агенты - это вещества способные встраиваться в ДНК:

-акридин оранжевый

-профлавин

-этидиум бромид

7.Выпадение нуклеотидов происходит под действием мутагенов.
^ 25.Спонтанные и индуцированные мутации. Мутагенные факторы и вызываемые ими повреждения структуры ДНК.

По причинам возникновения мутации бывают:

-спонтанные, чаще возникают при ошибке ДНК полимеразы

-индуцированные, возникают под действие каких либо факторов (мутагенов)

Мутагены - факторы, являющиеся причиной индуцированных мутаций. Они бывают:

а).физические: УФ-излучение; α,β,γ-лучи; температура и давление.

б).химические: азотистая кислота и её соли (происходит дезаминирование), соли тяжелых металлов, аналоги азотистых оснований (происходит таутомеризация), красители.

в).биологические: вирусы, мобильные генетические элементы (МГЭ).
^ 26.Многообразте систем репарации ДНК. Наследственные болезни человека, связанные с нарушением систем репарации.

Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней связан с нарушениями систем репарации.

У бактерий имеются, по крайней мере, 3 ферментные системы, ведущие к репарации — прямая, эксцизионная и пострепликативная.

^ Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нук-ов. Так действует, например, O6-метилгуанин ДНК-трансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

^ Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

Пострепликативная репарация. Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной репарации при помощи белка.

Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.
^ 27. Молекулярные механизмы процессов репарации ДНК.

Прямая репарация ДНК обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. Широко распространенная система репарации такого рода — фотореактивация пиримидиновых димеров. Кроме нее, к этому типу относятся: репарация ДНК за счет 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, репарация одноцепочечных разрывов ДНК с помощью полинуклеотиллигазы, а также генетическая репарация повреждений, вызванных алкильными или метильными группами, путем удаления этих групп специфическими ферментами.

Фотореактивация, уменьшение повреждающего действия ультрафиолетового излучения на живые клетки при последующем воздействии на них ярким видимым светом. В основе Ф. лежит ферментативное расщепление на мономеры пиримидиновых димеров, образующихся в ДНК под влиянием ультрафиолетового излучения. Ф. возникла в процессе эволюции как защитное приспособление от губительного действия УФ-компонента солнечного излучения и является одной из важнейших форм репариции живых организмов от повреждений их генетического аппарата. Восстановительный эффект при фотореактивации связан с действием фермента — дезоксирибозидпиримидинфотолиазы, представляющего собой полипептид, ассоциированный для его активности с небольшой молекулой РНК (10-15 нуклеотидов).

^ Эксцизионная репарация. включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

Коррекция неспаренных оснований есть широкое понятие, включающее и исправление ошибок репликации, и конверсию гена.

Неспаренные основания в ДНК могут возникать в результате трех событий:

1) прямого повреждения оснований ДНК или их предшественников продуктами клеточного метаболизма;

2) ошибочной подстановки некомплементарного основания ДНК-полимеразой в ходе репликации

3) рекомбинационной интеграции однонитевого участка ДНК в неабсолютно идентичную ДНК, партнера по рекомбинации.
^ 28. Этапы транскрипции прокариот.

Транскрипция-это процесс синтеза РНК на матрице ДНК.

Принципы:

-матричность

-комплиментарность

-антипараллельность

-униполярность

Условия: ДНК матрица (одна кодогенная цепь), NTP, РНК-полимераза, АТФ, среда, ионы магния. Только для эукариот: факторы транскрипции.

1.^ Инициация транскрипции:

-РНКполимераза в состоянии холо-фермента связывается с промотором

-плавление ДНК, в результате образуется открытый двойной комплекс

-синтез небольшого фрагмента РНК, образуется открытый тройной комплекс

-сигма-фактор уходит, РНКполимераза остается в состоянии кор-фермента

2. Элонгация транскрипции: РНКполимераза продвигается по ДНК, расплетаете и наращивает цепь.

3.Терминация транскрипции. Транскрипция заканчивается на терминаторе:

--ρ-независимая. Осуществляется путем образования шпилек. На терминаторе есть последовательности, которые слева направо и наоборот читаются одинаково-это полиндромы. При их считывании образуются шпильки, которые тянут вниз и разрушают связи.

-ρ-зависимая. Происходит при участии ρ-белка. ρ-белок GTFазной активностью, расшепляется, идёт энергия на разрыв связей ДНК-РНК, ρ-белок обладает геликазной активностью в отношении дуплекса ДНК-РНК.

^ 29.Строение промоторов генов прокариот. Строение РНК полимеразы эубактерий. Роль сигма-фактора в инициации транскрипции.

Промотр прокариот:

Кодогенная цепь:

3'________________________5'

-35 -10 +1

«-10» блок Прибнова или Прибнов бокс. ТАТААТ

«+1» САТ

«-35» это область узнавания. TTGACA

У прокариот РНКполимераза одного типа. Синтезирует все виды РНК. Состоит из нескольких субединиц. Может быть в двух сотояниях:

-кор-фермент: α,α,β,β',ω

-холо-фермент: α,α,β,β',ω,δ

В инициации транскрипции сигма-фактор (δ) узнает промотр и связывается с ним, затем сигма-фактор (δ) уходит, а РНК полимераза остается в состоянии кор-фермента.