Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностики бактериальных инфекций используют различные методы. Часто один из этих методов является основным, а другие — вспомогательными.

Материалом для проведения микробиологической диагностики могут быть мокрота, кровь, кал, рвотные массы, моча, желчь, кусочки поражённых тканей, пробы абиотической природы (вода, почва, воздух), пищевые продукты, фармацевтические препараты и др.

·Бактериоскопический (микроскопический) метод

Основан на изучении морфологических признаков возбудителя (определяют вид возбудителя по его форме, взаиморасположению клеток и способности окрашиваться определёнными красителями); различные микроскопические приёмы направлены на обнаружение микроорганизмов в нативных или окрашенных препаратах.

·Бактериологический метод

Основан на выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации. Проводится изучение культуральных и других физиологических свойств возбудителя, на основании чего проводят идентификацию и типирование возбудителей, а также изучают чувствительность к антибиотикам (антибиотикограмму).

·Биологический (экспериментальный) метод

Основан на изучении особенностей взаимодействия микроба с организмом экспериментальных животных в модельных опытах. Данную группу методов используют с целью:

- изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов;

- выделения чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы);

- воспроизведение экспериментальной инфекции с целью выявления особенностей инфекционного процесса (создание модельных систем);

- для испытания лечебных эффектов антибиотиков и других лекарственных препаратов.

·Серологический метод

Основан на определении в крови (сыворотке- serum) больных или переболевших специфических антител к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций. Основной принцип серологических реакций заключается в строго комплементарном взаимодействии АГ (антигена) с АТ (антителом). Серологические реакции могут быть использованы и для непосредственного обнаружения АГ возбудителя в исследуемом материале и изучения реакций макроорганизма на эти АГ (серологическая и аллергологическая диагностика инфекционного заболевания; антигенная идентификация микроорганизмов или их компонентов). В серологических реакциях один из компонентов всегда выступает в роли диагностикума (либо диагностическая сыворотка с АТ, либо диагностический АГ).

·Кожно-аллергический метод

Используют для выявления повышенной чувствительности (сенсибилизации) макроорганизма к определённым возбудителям или продуктам их жизнедеятельности (например, проба Манту с туберкулином на туберкулёз; проба с бруцеллином на бруцеллёз и т.д.) Положительные пробы не свидетельствуют о наличии самого возбудителя и собственно заболевания. Они лишь являются свидетельством недавнего контакта с больным человеком, возможной инфицированности (носительстве) или о болезни в прошлом.

·Молекулярно-генетический метод

Основан на обнаружении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале при помощи молекулярной гибридизации ДНК или РНК, а также ПЦР. Этот метод позволяет обнаружить возбудителя по нескольким молекулам ДНК, содержащихся в крови или поражённых клетках хозяина. Их проводят в случаях, если:

- трудно выделить чистую культуру возбудителя из-за сложности его культивирования;

- возбудитель характеризуется высокой антигенной изменчивостью;

- в исследуемом материале имеется крайне низкая концентрация возбудителя или наблюдается длительная его персистенция в организме человека.

Этапы приготовления мазков-препаратов

Приготовление состоит из нескольких последовательных операций:

1. Подготовка мазка

2. Высушивание

3. Фиксация

4. Окраска

Техника приготовления мазка из бактериальной культуры:

- исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло, очертив предварительно с обратной стороны стекла восковым карандашом границы препарата.

- если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора;

- нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки;

- берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони;

- обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю (петлю остужают о внутреннюю стенку пробирки) и берут исследуемый материал;

- вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой;

- микробиологический материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки.

Высушивание и фиксация мазков препаратов.

Изготовленные мазки высушивают при комнатной температуре или в термостате. Тонкие мазки быстро высыхают на воздухе, более толстые можно высушивать над пламенем горелки или спиртовки. Предметное стекло при этом держат пинцетом (или за ребра 1-м и 2-м пальцами правой руки) мазком кверху. Чтобы не допустить денатурации белков бактерий и нарушения их внутренней структуры степень нагревания контролируют, прикасаясь к тыльной стороне ладони – должно ощущаться легкое чувство жжения.

Высушенные препараты необходимо фиксировать к поверхности стекла. Для того, чтобы убить и закрепить бактерий на стекле, предотвратив их смывание в процессе окраски. К тому же убитые микроорганизмы значительно лучше окрашиваются, а также не представляют опасности для работающих.

В лабораторной практике самым распространенным методом фиксации мазков является фламбирование - то есть фиксация в пламени газовой горелки или спиртовки. При этом мазок держат так же, как при высушивании и трижды проводят его через пламя. Весь процесс фиксации длится 5-6 с, а действие температуры - 2 с. Более длительная фиксация уменьшает качества препарата, а недофиксированный мазок при следующей обработке смывается и таит в себе опасность заражения.

При изучении некоторых структур микробных клеток, а также мазков крови, отпечатков органов, которые деформируются при высокой температуре фиксируют химическим способом, при помощи одной из фиксирующих жидкостей: этанолом (на протяжении 10-15 мин), метанолом (5 мин), ацетоном (5 мин), смесью Никифорова (10-15 мин), парами формалина или осмиевой кислоты (несколько секунд). При такой осторожной фиксации значительно лучше сохраняются и просмотриваются все структуры клеток и бактерий.

Окраска препаратов

Существуют простые и сложные методы окраски. При окраске простым методом используется только один краситель, позволяющий отличить клетки от неокрашенного фона, Простой метод окрашивания дает возможность исследовать общую морфологию микробов, их размеры, форму, количество, локализацию, взаимное расположение клеток и т. п.. Но с его помощью невозможно изучать внутреннюю структуру бактерий и их разное отношение к нескольким красителям.

Простым окрашиванием называют такое, при котором применяют лишь один краситель. Чаще всего используют основной разведенный фуксин Пфейффера и щелочную метиленовую синьку Леффлера. Фуксином красят 1-2 мин, а синькой 3-5 мин. Препараты, которые содержат, кроме бактерий, тканевые и клеточные элементы макроорганизма, лучше окрашивать метиленовой синькой, которая красит фон препарата сравнительно слабо, а бактерии значительно интенсивнее.После истечения времени окрашивания препарат промывают дистиллированной водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем мазки высушивают на воздухе или между листами фильтровальной бумаги и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива.

При окраске сложным методом используют несколько последовательно наносимых красителей, фиксатор и проявитель (окраска по методу Грама и др.).

ЧАСТЬ 2

Различия в окраске по Граму связаны с некоторыми особенностями строения клеточной стенки бактерий. В однослойной клеточной стенке грамположительных микробов имеется несколько рядов пептидогликана (до 80 % от массы клеточной стенки), поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса, образуемого при взаимодействии красителя генцианового фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода, входящего в состав люголя. Также в поверхностном слое клетки находится магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основным красителем – генциановым фиолетовым. Поэтому грамположительные микробы прочно удерживают первый наносимый краситель – генциан-виолет и окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов имеется двуслойная клеточная стенка. Во внутренний слой входят всего один-два ряда пептидогликана. Верхний слой представлен наружной мембраной, включает фосфолипиды, белки и липополисахарид (ЛПС). Отсутствует магниевая соль рибонуклеиновой кислоты. В связи с этим не образуется прочного соединения компонентов клеточной стенки с основным красителем. Они легко обесцвечиваются этиловым спиртом. Поэтому клетки бактерий окрашиваются в цвет последнего наносимого на их поверхность красителя (водный фуксин) – в красный.

Техника окраски по Граму:

1. Фиксированный мазок кладут на рельсы и накрывают бумажкой по Синеву с генцианфиолетовым, заливают ее водой или наливают на мазок генциан-виолетом через фильтровальную бумагу. Экспозиция 2 мин.

2. Снимают бумажку и наливают раствор Люголя на 1 -2 минуты.

3. Сливают Люголь в кювету, на мазок наливыют с 96˚ этиловый спирт до прекращения отхождения «струею» красителя, примерно 10-15 сек.

4. Промывают проточной водой, стряхивают воду.

5. Наносят фуксин Пфейффера.Экспозиция 2 мин.

5. Промывают проточной водой и сушат в вертикальном положении.

6. Микроскопируют с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Отличительные признаки