Влияние рН на активность амилазы слюны.

Зависимость активности ферментов от концентрации Н-ионов можно проследить в опытах с амилазой слюны, рН-оптимум которой равен 6,8.

Ход работы: В три пробирки внести по 3 мл буферного раствора с рН 1,2; 6,8; 10,0. Добавить в каждую пробирку по 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз, и по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала. Смешать и инкубировать при 37^о С 10мин. Подкислить содержимое второй и третьей пробирок добавлением соответственно 1 и 2 мл 0,1 н соляной кислоты ( реакция на крахмал положительна только в кислой среде) и провести пробу Люголя. Сравнить интенсивность распада крахмала зависимости от рН. Построить график зависимости скорости реакции от рН среды. Определить рН-оптимум амилазы слюны.

 3. Специфичность действия ферментов.Специфическими субстратами амилазы слюны являются крахмал и гликоген, расщепление которых амилаза катализирует. Образующаяся при расщеплении крахмала мальтоза обнаруживается пробой Троммера.

Используя в качестве субстрата сахарозу, можно убедиться в том, что амилаза не катализирует распад сахарозы.

Ход работы: В одну пробирку внести 2 мл 0,5%-ого раствора крахмала, в другую – 2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Добавить в обе пробирки по 2 мл слюны, разведенной в 10 раз водой, смешать и оставить на 10 мин при 37^о С.

Провести с содержимым обеих пробирок пробу Троммера. Она окажется положительной при наличии редуцирующего углевода – мальтозы (пробирка первая) и отрицательной в присутствии редуцирующего углевода (пробирка вторая).

 Дайте обоснованные ответы на следующее:

1.Какой из предложенных ниже способов можно использовать для определения активности амилазы слюны:

а. по определению остаточной концентрации крахмала;

б. по нарастанию количества мальтозы;

в. по изменению рН среды в ходе реакции.

2. Скорость взаимодействия А+Б увеличилась после добавления вещества К в три раза. В качестве конечных продуктов обнаруживаются соединения АК и БК. Является ли вещество Ккатализатором?

3.Построить график зависимости V от [S] по экспериментальным данным: [S] - 1, 2, 4,6,10,15,17,18,22 мМоль/л; соответственно V равна: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1.5; 1,6; 1,6; 1,6

Определить с помощью графика константу Михаэлиса. Как по константе Михаэлиса судят о степени сродства энзима к субстрату?

 4. Фермент катализирует реакцию расщепления пептидных связей в молекуле белка. Назовите класс и подкласс фермента.

5. Фермент катализирует отщепление карбоксильной группы в виде СО₂ от молекулы аминокислоты. Назовите класс и подкласс фермента.

6. Фермент катализирует перенос аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту. Назовите класс и подкласс фермента.

7. Фермент катализирует превращение молекулы глюкозы в молекулу фруктозы. Назовите класс фермента.

8. При определении активности фермента получены данные, представленные в таблице:

Построить график зависимости активности фермента от рН, высказать предположение о том, какой фермент находится в растворе, определить принадлежность фермента к классу и группе соответственно высказанному предположению.

9. Субстрат исследуемого фермента образует белый осадок при нагревании, дает положительную биуретовую реакцию. После длительной инкубации с ферментом при разных значениях рН интенсивность биуретовой реакции снизилась, увеличилось число свободных аминогрупп, усилилась положительная реакция с нингидрином. Особенно заметными эти изменения были при рН 8,0-8,5.

Назовите субстрат, фермент, определите принадлежность фермента к классу и группе. Почему увеличилось число свободных аминогрупп?

Сравните Ваши ответы с эталонными ответами и рассчитайте % правильных ответов. Выявите с помощью лекций и учебника причину Ваших ошибок.

Занятие 8-9. Эффекторы ферментов.

Цель: изучить механизмы действия активаторов и ингибиторов ферментов, их классификацию и номенклатуру.Ознакомиться с одним из количественных методов определения активности фермента.

Студент должен знать:

1. Механизмы регуляции активности ферментов.

2. Классификацию ферментативных эффекторов, их разделение на подгруппы в зависимости от механизма действия. Их механизмы действия (обратимы и необратимые ингибиторы; активаторы; конкурентные и неконкурентные ингибиторы, примеры, значение).

3. Особенности строения, функционирования и локализации аллостерических ферментов.

4. Особенности и биологическое значение аллостерических эффекторов. Аллостерическая регуляция.

5. Понятие об изоферментах.

6. Понятие об энзимопатиях.

7.Понятие об энзимодиагностике. Причины, приводящие к увеличению количества ферментов в крови.

8.Понятие «профермент» и механизмы превращения проферментов в фермент.

9. Принципы определения активности фермента.

10. Принципы обнаружения в биологической жидкости активатора или ингибитора.

Студент должен уметь:

1. Строить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного и неконкурентного ингибитора. Оценить кинетические параметры: Vмах и Км.

2. Строить график зависимости скорости реакции, катализируемой аллостерическим ферментом, от концентрации субстрата.

3. Определить активность диастазы в моче. Оценить полученные результаты.

Студент должен получить представление :

1. О заболеваниях, вызванных появлением в избытке физиологических ингибиторов ферментов;

2. Об использовании эффекторов ферментов в медицине (эффекторы как фармпрепараты).

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

 Запомните, что скорость ферментативной реакции зависит от количества субстрата, количества фермента или от его активности. Изменение активности фермента связано с изменением конформации белковой молекулы фермента и его активного центра.