Опыт 5. Качественные реакции на углеводы

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

Физиология растительной клетки.

Цель работы:изучить вязкость цитоплазмы в зависимости от возраста листа и проницаемость цитоплазмы для различных красителей; химический состав растительной клетки.

Опыт 1. Определение вязкости цитоплазмы по времени плазмолиза

Цель опыта: ознакомиться с методом определения вязкости цитоплазмы по времени плазмолиза.

Материалы и оборудование:0,8 М раствор сахарозы в капельнице; лезвие бритвы; препаровальная игла; пинцет; микроскоп; предметные и покровные стекла.

Растения: веточки элодеи; луковица синего лука или листья традесканции;

Промежуток времени от момента погружения клеток в гипертонический раствор до появления выпуклого плазмолиза называют временем плазмолиза. Это время зависит от вязкости цитоплазмы: чем меньше вязкость, тем легче цитоплазма отстает от клеточной стенки и тем быстрее вогнутый плазмолиз переходит в выпуклый. Вязкость цитоплазмы зависит от степени дисперсности и гидратации коллоидов, от содержания в клетке воды и ряда других факторов.

Цитоплазма растущих клеток и клеток, закончивших рост, имеет разную вязкость.

Для опыта используют молодые листочки элодеи, в которых можно различить четыре зоны: в основании расположена слабо окрашенная зона деления клеток, выше находится зона растяжения, еще выше – зона дифференцировки и, наконец, верхушка листа, которая состоит из клеток, закончивших свой рост и имеющих интенсивно зеленую окраску.

Ход работы.Взять 2–3 молодых листочка из верхушечной части побега элодеи (листья должны иметь зеленый кончик и бледно-зеленое основание), погрузить в каплю 0,8 М раствора сахарозы на предметном стекле и закрыть покровным стеклом. для сравнения в другую каплю раствора сахарозы поместить срез эпидермиса синего лука или традесканции. Отметить время погружения исследуемых объектов в раствор. Рассматривая препараты в микроскоп через каждые 5 мин, определить время плазмолиза, причем у листа элодеи следует наблюдать за клетками различных зон.

Задание: записать результаты и сделать вывод о зависимости вязкости цитоплазмы от возраста клетки.

Опыт 2. Накопление метиленовой синей в клетках элодеи

Цель опыта: ознакомиться с методом определения проницаемости цитоплазмы.

Материалы и оборудование: раствор метиленовой синей 1: 50 000 (20 мг в 1 л водопроводной воды); 1М раствор КNO₃ в капельнице; пинцет; штатив с пробирками (2 шт.); микроскоп; предметные и покровные стекла; полоски фильтрованной бумаги.

Растения: побеги элодеи длиной около 10 см.

В предыдущих опытах было продемонстрировано важнейшее свойство цитоплазмы – полупроницаемость, т. е. способность легко пропускать воду и задерживать растворенные вещества. Однако цитоплазма не обладает идеальной полупроницаемостью: она пропускает не только воду, но и многие вещества, причем некоторые из них со значительной скоростью. К числу таких веществ относится метиленовая синяя, которая довольно быстро проникает в растительные клетки. Ткани некоторых растений способны накапливать большое количество метиленовой синей вплоть до почти полного извлечения ее наружного раствора вследствие химического связывания краски содержащимся в клетках дубильными веществами, причем нередко образуются небольшие синие кристаллы.

Ход работы.Заполнить две пробирки раствором метиленовой синей. Поместить в одну пробирку 2–3 побега элодеи, вторую оставить в качестве контроля. Через 2–3 ч (или через сутки) отметить изменение интенсивности окраски в сосуде с растениями по сравнению с контролем (рассматривать на светлом фоне). Поместить 1–2 интенсивно окрашенных листочка на предметное стекло в каплю 1 М раствора KNO₃, накрыть покровным стеклом и через 15–20 мин рассмотреть в микроскоп при большом увеличении.

Задание: зарисовать плазмолизированную клетку, отметив, какая часть окрашена красителем (клеточная стенка, цитоплазма или вакуоль) и в какой цвет (раскрасить цветным карандашом).

Опыт 3. Прижизненное окрашивание клеток нейтральным красным

Цель опыта: ознакомиться с методом определения проницаемости цитоплазмы.

Материалы и оборудование: 0,02%-й раствор нейтрального красного в капельнице; 1М раствор КNO₃ в капельнице; скальпель; лезвие бритвы; препаровальная игла; микроскоп; предметные и покровные стекла; стеклянная палочка; стаканчик с водичкой; кусочки фильтрованной бумаги; цветные карандаши.

Растения: луковица обыкновенного лука, листья разных растений.

Подобно метиленовой синей краска нейтральный красный способна проникать в живые клетки и накапливаться в них в больших количествах. При непродолжительном прибывании клеток в растворе нейтрального красного цитоплазма не отмирает, в чем можно убедиться, вызвав плазмолиз окрашенных клеток (плазмолизироваться могут только живые клетки). Нейтральный красный – двухцветный индикатор: в кислой среде (рН < 6) он имеет малиновую окраску, в щелочной – желтую.

Для понимая результатов данной работы необходимо иметь в виду, что в растворе рН около 7 нейтральный красный находится в форме недиссоциированных молекул, хорошо растворимых в липидах мембран, тогда как в кислой среде (рН < 6) это вещество диссоциирует на ионы, плохо растворимые в липидах.

Ход работы.Приготовить 2–3 среза эпидермиса чешуи обыкновенного лука или листьев каких либо других растений и поместить их на предметное стекло в большую каплю раствора нейтрального красного, не накрывая покровным стеклом (при хорошем доступе воздуха окрашивание происходит быстрее). Через 10–15 мин (не более) отсосать раствор краски фильтрованной бумагой, перенести срезы в каплю воды, накрыть покровным стеклом и рассмотреть в микроскоп. Заменить воду 1М раствором KNO₃ и продолжать наблюдение при большом увеличении.

Задание: зарисовать плазмолизированную клетку, отметив, какая часть окрашена красителем (клеточная стенка, цитоплазма или вакуоль) и в какой цвет (раскрасить цветным карандашом).

Опыт 4. Качественные реакции на белки

Цель опыта: провести качественные реакции на белки.

Материалы и оборудование:10%-й раствор  едкого натрия; 1%-й раствор сернокислой меди; азотная кислота концентрированная; серная кислота концентрированная; уксусная кислота ледяная; 25% аммиак; контрольный раствор 0,3% белка (альбумина); пипетки с делением до 1 мл; воронки обыкновенные (маленькие); штатив для пробирок; пробирки.

Растения: листья и семена различных растений.

1. Биуретовая реакция. Биуретовая реакция обуславливается присутствием в молекуле пептидной группы  –СО–NH–, входящей в состав биурета, откуда и произошло название самой реакции. Ее дают не только белки, но и полипептиды.

Ход работы.

Приготовить водные растворы из измельченных листьев и размолотых семян. Для этого мелко измельченные или порезанные растительные объекты поместить в воду, взболтать и экстрагировать 15-20 мин. Полученный раствор отфильтровать через фильтр или ткань. Разделите полученные фильтраты и остатки на несколько частей и используйте их в реакциях на углеводы. Провести реакцию с фильтратом и остатком; в качестве сравнения с контрольным раствором белка. Можно попробовать провести реакцию на живых срезах листьев и семян.

К исследуемому раствору (2–3 мл) или остатку приливают 1–2 мл 10%-го раствора щелочи и несколько капель 1%-го раствора медного купороса. В присутствии белковых веществ жидкость окрашивается в фиолетовый цвет. Не следует приливать избытка медного купороса, т. к. в этом случае фиолетовая окраска будет замаскирована синей.

2. Ксантопротеиновая реакция. Большинство белков при нагревании их с крепкой азотной кислотой дает желтое окрашивание. Желтый – по-гречески «ксантос», откуда и произошло название ксантопротеиновой реакции. Эту реакцию дают все белки, содержащие циклические аминокислоты (венилаланин, тирозин, триптофан). Химизм реакции сводится к нитрованию бензольного кольца с образованием нитросоединений желтого цвета. Этим же объясняется появление желтого окрашивания при попадании концентрированной азотной кислоты на кожу, шерсть и т. д.

Ход работы.К исследуемому раствору или остатку, к контрольному раствору в пробирке приливают 1–2 мл концентрированной азотной кислоты. Проявление желтого осадка при нагревании указывает на присутствие белка. После прибавления к раствору избытка аммиака желтый цвет осадка переходит в оранжевый.

3. Реакция Адамкевича. При действии на белок глиоксиловой кислоты в присутствии концентрированной серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание раствора, связанное с присутствием в белке триптофана.

Ход работы.Наливают в пробирку несколько капель исследуемого раствора или остатка, контрольного раствора и прибавляют 1 мл концентрированной уксусной кислоты, которая всегда содержит в качестве примеси глиоксиловую кислоту. Сильно наклоняют пробирку и осторожно по стенке вливают в нее 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы жидкости не смешались; при этом на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо, появление которого свидетельствует о присутствии в белке триптофана.

Задание: описать реакции на белок у разных объектов, сделать вывод о содержании белков в различных частях растений.

Опыт 5. Качественные реакции на углеводы

Цель опыта: провести качественные реакции на углеводы.

Материалы и оборудование:10%-й раствор натрия едкого; 1%-й раствор меди сернокислой; реактив Фелинга; 10%-й раствор аммиака; соляная кислота; резорцин в растворе или в кристаллах; раствор Люголя (1% йод в йодистом калии); для контроля можете использовать 1%-й раствор сахара (глюкозы) и  1%-й раствор крахмала; штатив с набором пробирок.

Растения: листья и семена различных растений.

1. Реакция Троммера. Окислителем является гидрат окиси меди, восстанавливающийся в присутствии редуцирующих сахаров до гидрата закиси или закиси меди.

Ход работы.К 2 мл исследуемого раствора или остатка, контрольного раствора приливают 1 мл 10%-го раствора едкого натрия и по каплям 1%-го раствора медного купороса до появления мути голубого цвета. Затем смесь в пробирке нагревают до кипения. Появление желтого (гидрат закиси меди) или красного (закись меди) осадка указывает на присутствие в растворе сахара.

При этом происходят следующие реакции:

1) CuSO₄ + 2NaOH → Cu(OH)₂ + Na₂SO₄;

                                   O

                                  //

2) 2Cu(OH)₂ + CH₂OH - C - H →  2CuOH + H₂O + CH₂OH - (CHOH)₄ - COOH;

3) 2CuOH →  Cu₂O + H₂O.

2. Реакция Фелинга. Окислителем также является гидрат окиси меди. Эта реакция отличается от предыдущей тем, что к реагирующей смеси добавляется сегнетовая соль для связывания избытка гидрата окиси меди. Сегнетовая соль является двойной солью винной кислоты:

COONa                                COONa

\                                              \

HCOH                                   HC - O \

/                                       |        Cu

HCOH + Cu(OH)₂     →       HC - O /  + H₂O

|

COOK

Фелинга реактив или фелингова жидкость - это смесь равных объёмов 7%-ного раствора сульфата меди и 34,6%-ного раствора сегнетовой соли в 10%-ном растворе едкого натра. Применяется для качественного и количественного определения альдегидов жирного ряда и в особенности моносахаридов. Действие реактива Фелинга основано на восстановлении иона двухвалентной меди до одновалентной за счёт окисления альдегидных групп исследуемых соединений. При этом на холоде выпадает оранжево-жёлтый осадок гидрата закиси меди СuОН, а при нагревании – красный осадок закиси меди СuO. Предложен в 1850 нем. химиком Г. Фелингом.

Ход работы.К 2 мл исследуемого раствора или остатка, контрольного раствора приливают 0,5 мл реактива Фелинга и нагревают до кипения. При этом появляется красный осадок закиси меди. При наличии в растворе небольшого количества сахара выпадает желтый осадок гидрата закиси меди.

3. Реакция Селиванова. Применяется для обнаружения кетоз. Она особенно хорошо получается с фруктозой и полисахаридами, дающими при гидролизе фруктозу (например, сахароза). Реакция Селиванова основана на образовании оксиметилфурфурола, дающего с резорцином красное окрашивание.

Ход работы.К 1 мл исследуемого раствора или остатка, контрольного раствора приливают 1 мл концентрированной соляной кислоты и прибавляют несколько кристалликов резорцина.

Пробирку с жидкостью нагревают в течение 1–2 минут на кипящей водяной бане. В случае присутствия в растворе сахаров, содержащих кетогруппу, жидкость окрашивается в красный цвет.

4. Цветная реакция на крахмал. К 2 мл исследуемого раствора и/или остатка, контрольного раствора приливают одну каплю раствора Люголя. При этом жидкость окрашивается в синий цвет.

Задание: описать реакции на углеводы у разных растительных объектов, сделать вывод о содержании углеводов в различных частях растений.