Первый этап выделения чистой культуры

1. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.
2. Производят посев на чашки Петри с питательным агаром. Для этого исследуемый материал, в случае необходимости, разводят стерильным физиологическим раствором. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательной среды в чашке Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещяют в термостат при 37ºС на 18-24 ч.
3. Производят посев на элективную питательную среду.
4. Производят посев на дифференциально-диагностическую среду.
5. Заражают лабораторных животных исследуемым материалом.

53.Рост и размножение бактерий, понятия, фазы роста.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:

1.лаг-фаза;

2.фаза логарифмического роста;

3.фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4.фаза гибели бактерий.

Лаг-фаза — период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде.Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

54.Среда Плоскерева, ее характеристика.

Среда Плоскирева (именуемая еще бактоагаром Ж) является питательной средой для выращивания некоторых микроорганизмов, в основном шигелл и сальмонелл. Как источник для нее используют инфицированные материалы: мочу, желчь, испражнения.

Среда Плоскирева - материал для культивирования кишечных бактерий, а значит, должна содержать несколько видов питательных веществ. Выпускается она в сухом виде. Довольно большую долю в ее общей массе имеет панкреатический гидролизат кильки (10,4 г/л). Чуть меньше приходится на двузамещенный гидроцитрат натрия (8,5 г/л). Также здесь содержится сухой питательный бульон и молочный сахар (8,62 и 7,3 г/л). Второе название среды Плоскирева - бактоагар Ж. В составе его присутствует агар в количестве 6,94 г/л. Содержание безводного сериоватистокислого натрия равно 5,1 г/л. Имеется наличие обезвоженного фосфата динатрия - 2,1 г/л, натриевых солей желчных кислот около 3,46 г/л, а кальцинированной соды - 2,4 г.

55.Влияние физических и химических факторов на бактерии. Стерилизация, способы, контроль их качества

Микроорганизмы находятся в тесной зависимости от условий окружающей среды. Выделяют физические, химические и биологические факторы внешней среды, влияющие на микроорганизмы. Физические факторы. Из физических факторов наибольшее влияние на микроорганизмы оказывают температура, влажность, излучение. Температура. По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные. Для мезофилов оптимальные температуры роста лежат между 20 и 40°С. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от 0 до 20°С. Термофильные бактерии растут при температурах от 40 до 98°С. Для сохранения жизнеспособности бактерий благоприятны низкие температуры (ниже 0°С). Споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (температура минус 196°С). Влажность. Важнейшим фактором поддержания жизнеспособности микробной клетки является вода, поскольку именно в растворах протекают все биологические процессы. Вода находится в клетке в свободном или связанном состоянии. Действие излучения. Солнечный свет может обеспечивать выраженный антимикробный эффект. Ультрафиолетовое излучение вызывает замедление роста культур, снижает скорость деления клеток, способствует развитию мутаций. УФ-лучи широко применяются для обеззараживания воздуха в помещениях, воды, отходов производства .Ионизирующее излучение вызывает повреждения ДНК, которые принято подразделять на прямые и опосредованные, возникающие в связи с образованием свободных радикалов. Ионизирующее излучение используется для стерилизации биопрепаратов, перевязочного материала, инструментов. Действие лазера вызывает у микроорганизмов в зависимости от дозы облучения изменения морфологических и биохимических свойств, вплоть до утраты жизнеспособности. При этом происходит денатурация белка и повреждение нуклеиновых кислот. Влияние химических факторов на микроорганизмы. Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на микроорганизм непосредственно или косвенно. От значения рН зависит состояние веществ в окружающей среде. Многие органические кислоты в кислой среде находятся в недиссоциированной форме и легко проникают в клетку, становясь токсичными для нее. Границы значений рН, оптимальных для роста различных микроорганизмов, находятся в пределах от 1,0 до 11,0. В зависимости от отношения к кислотности среды прокариоты могут быть разделены на несколько групп. Для подавляющего большинства прокариотов оптимальной является среда, близкая к нейтральной. Такие организмы называют нейтрофилами. Многие нейтрофилы способны расти или выживать при значениях рН, лежащих за пределами указанного диапазона. Такие прокариоты считаются кислото- или щелочеустойчивыми. К кислотоустойчивым относятся многие грибы, микобактерии (туберкулезная палочка). Устойчивыми к значениям рН близким к 9,0-10,0, являются многие из кишечных бактерий. У некоторых видов бактерий оптимум рН для роста находится в кислой (рН 4,0 и ниже) или щелочной (рН от 9,0 и выше) области. Такие бактерии называются ацидофильными и алкалофильными (кислотолюбивыми или щелочелюбивыми), соответственно. Соединения и ионы, токсичные для бактерий. Действие токсичных для бактерий соединений может быть бактериостатическим или бактерицидным. Бактериостаз – это задержка роста и размножения бактерий, вызванная действием неблагоприятных химических или физических факторов. Прекращение действия фактора приводит к возобновлению роста и деления. Бактерицидные факторы вызывают гибель клеток. Во многих случаях вещество в небольших концентрациях обладает бактериостатическим, а в высоких - бактерицидным действием. Стерилизация - это процесс уничтожения всех видов микробной флоры, в том числе их споровых форм, и вирусов с помощью физических или химических воздействий. Принято считать медицинское изделие стерильным, если вероятность его бионагрузки равна или менее 10 в степени -6. Стерилизации должны подвергаться медицинские изделия, контактирующие с кровью пациента, контактирующие с раневой поверхностью и соприкасающиеся со слизистой оболочкой и могущие вызвать нарушение ее целостности. Стерилизация -сложный процесс, для успешной реализации которого необходимы следующие требования:

- эффективная очистка;

- соответствующие упаковочные материалы;

- соблюдение правил упаковки медицинских изделий;

- соблюдение правил по загрузке стерилизатора упаковками с медицинскими изделиями;

- адекватное качество и количество стерилизуемого материала; соответствующая работа оборудования;

- соблюдение правил хранения, обращения и транспортировки простерилизованного материала.

56.Материальная основа наследственности микробов. Генотип, фенотип

Генотип- это общая сумма генов микроба. В отношении микро­организмов "генотип" означает то же, что "геном".

Фенотип- это весь комплекс свойств микроба, проявление генотипа в определенных, конкретных условиях существования.

Генотип - это возможные способности клетки, а фенотип - видимое их проявление. Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства микроорганизмов, является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка, называется геном. В генах закодирована генетическая информация о всех свойствах клетки: форме, структуре белков и их функциях. Полный набор генов, которыми обладает клетка, представляет ее генотип. Генотип определяет потенциальную возможность проявления свойств клетки микроорганизма.

Бактериальная клетка имеет множество генов, каждый из которых несет информацию и контролирует синтез одного белка или соответствующего соединения. Гены подразделяются на структурные гены, гены-регуляторы и гены-операторы. В структурных генах закодирована информация о первичном строении контролируемого ими белка, т.е. о последовательности расположения аминокислот, входящих в состав белка. Гены-регуляторы контролируют синтез белков-репрессоров, подавляющих функцию структурных генов, а гены-операторы выполняют роль посредников между генами регуляторами и структурными генами.

Гены обозначают строчными начальными буквами названия синтезируемого под их контролем соединения (например, his – гистидиновый ген, arg – аргининовый ген, lac и mal – гены, контролирующие расщепление coответственно лактозы мальтозы).

Свойства микроорганизмов, проявляемые в тех или иных условиях их су­ществования, называют фенотипом. Другими словами, фенотип представляет собой сумму признаков, определяемых генотипом, реализованных в конкретных условиях внешней среды. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут образовывать особи с разными фенотипами. Фенотип бактерий обозначается теми же символами, что и генотип, но первая буква прописная (His , Arg , Lac и др.)

Фенотипические изменения

При фенотипической изменчивости микробы, образовавшиеся из одной материнской клетки, могут различаться между собой по ферментативной активности, морфологическим признакам, потребности в источниках питания.

К фенотипической изменчивости относятся:

Адаптация – приспособление микроорганизмов к новым условиям среды. В настоящее время это явление объясняется не изменением в микробной клетке, а развитием ранее измененных особей и гибелью неприспособленных. Таким образом, происходит естественный отбор.

Диссоциация – культурная изменчивость, когда, например, из засеянной на плотную среду чистой культуры вырастают резко отличающиеся по морфологической структуре колонии (тип S – гладкие, тип R – шероховатые, тип M – слизистые).

Модификация – изменение микроорганизмов под влиянием условий среды. Изменяются только фенотипические (внешние) признаки (форма, размеры, цвет колоний). Модификация наблюдается в нормальных условиях жизни, это реакция на внешние раздражения, не связанные с нарушением физиологических процессов в организме. Модификационные изменения легко исчезают при устранении условий, их вызвавших.

Генотипические изменения. Изменчивость признаков микроорганизмов, обусловленная перестройкой генетического аппарата, проявляется в виде мутаций и генетических рекомбинации (комбинативные изменения).

Мутации – внезапные, скачкообразные изменения генов. Процесс мутирования генов приводит к таким изменениям, которые передаются по наследству и сохраняются даже тогда, когда вызвавший их фактор перестает действовать.

Спонтанные мутации (без направленного воздействия) очень редки: примерно одна на 100 тыс. Онихарактеризуются изменениемкакого-нибудьодногопризнака и обычно стабильны.

Индуцированные или мутагенные мутации возникают вследствие воздействия факторов среды. Они встречаются сравнительно часто. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовые, рентгеновские и радиоактивные излучения, которые вызывают повреждение генетического аппарата клетки. К химическим мутагенам относятся сильнодействующие вещества: отравляющие (иприт), лекарственные (йод, перекись водорода), кислоты и др. Примером биологических мутагенов может быть ДНК.

Бактериальные клетки, в которых произошла мутация, называют мутантами.

Генетические рекомбинации заключаются в объединении и обычно немедленной перетасовке генов, принадлежащих близкородственным, но генотипически различным организмам.

Генетические рекомбинации у эукариот – это образование индивидумов с новым сочетанием продуктов в результате полового процесса.

У прокариот комбинативные изменения проявляются в результате трансформации, трансдукции, конъюгации.

Трансформация – перенос генетической информации от бактерии донора (в форме отдельных фрагментов ее ДНК) в клетку реципиента. Наиболее эффективно трансформация происходит у бактерий одного и того же вида или близкородственных видов. При этом в хромосому реципиента включается только одна нить ДНК донора с образованием молекулярной гетерозиготы.

Обычно бактериальная клетка в результате трансформации приобретает одно свойство. С помощью трансформирующей ДНК передаются такие признаки, как капсулообразование, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и т.д.

Трансдукция – перенос генов (фрагментов ДНК) от донорской клетки бактерии к реципиентной посредством умеренного фага.

При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих особенности питания бактерий, двигательный аппарат (жгутики) и другие свойства.

Конъюгация – форма полового процесса, при котором происходят соединение мужской и женской микробных клеток и обмен между ними ядерным веществом через цитоплазматический мостик, образующийся между клетками. При этом генетический материал клетки-донора переходит в клетку-реципиент. После рекомбинации и деления клетки образуются формы с признаками конъюгирующих клеток.

Таким образом, все три формы комбинативной изменчивости одинаковы по существу. При трансформации участок ДНК клетки-донора входит в клетку-реципиент; при трансдукции эту роль выполняет фаг, а при конъюгации перенос генетической информации осуществляется через цитоплазмитический мостик (пили).

Вследствие генетических рекомбинаций образуются новые бактериальные клетки – рекомбинанты, у которых имеются наследственные признаки обоих «родителей».

57. Методика окраски спор

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5% -ной соляной кислотой с подогреванием (2-3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7-8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5% -ным раствором серной кислоты (5-7 с), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4-5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5% -ной хромовой кислотой (2-3 мин), промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Далее поступают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в красный.

58. Плазмиды бактерий, их свойства. Транспозоны, вставки-последовательности, их характеристика.

Плазмиды — фрагменты ДНК, несущие от 40 до 50 генов. Выделяют автономные и интегрированные плазмиды.

• Автономные плазмиды существуют в цитоплазме бактерий и способны самостоятельно репродуцироваться; в клетке может присутствовать несколько их копий.

• Интегрированные плазмиды репродуцируются одновременно с бактериальной хромосомой. Интеграция плазмид происходит при наличии гомологичных последовательностей ДНК.

Плазмиды выполняют регуляторные или кодирующие функции. Регуляторные плазмиды участвуют в компенсировании тех или иных дефектов метаболизма бактериальной клетки. Кодирующие плазмиды привносят в бактериальную клетку новую генетическую информацию.

Выделяют следующие группы плазмид:

F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров с бактериями-реципиентами.

R-плазмиды кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к), а также к тяжёлым металлам.

Транспозоны

Представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие 2000-20500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. Транспозоны реплицируются только в составе бактериальной хромосомы. Οʜᴎ могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, ферментов, разрушающим антибиотики.

IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (insertion – вставка, sequence – последовательность) (вставки последовательностей оснований)– представляют собой транспозируемые элементы. Это фрагменты ДНК длиной >1000 пар нуклеотидов. Их функции:

1. Содержание информации, крайне важной для транспозиции, ᴛ.ᴇ. перемещения в различные участки ДНК.

2. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и профагов между собой и с хромосомой бактериальной клетки.

3. Вызывать инактивацию, «выключение» определœенного гена.

4. Индуцировать мутации.

59. Основные отличия прокариот от эукариот. Формы бактерий с дефектом синтеза клеточной стенки.

Главное отличие

У прокариот нет ядра, кольцевая ДНК расположена прямо в цитоплазме (это нуклеоид).У эукариот есть оформленное ядро.

Дополнительные отличия

1) Раз у прокариот нет ядра, то нет и митоза/мейоза. Бактерии размножаются делением надвое.

2) У прокариот рибосомы мелкие (70S), а у эукариот – крупные (80S).
3) У эукариот имеется множество органоидов.

4) Клетка прокариот гораздо меньше клетки эукариот: по диаметру в 10 раз, по объему – в 1000 раз.