Биохимические свойства бактерий

Физиология бактерий (часть вторая)

Методы культивирования анаэробных бактерий

Культивирование анаэробных бактерий как спорообразующих (клостридии – возбудители столбняка, ботулизма и газовой гангрены). так и неспорообразующих (вейлонеллы, бактероиды и др.) производят в анаэробных условиях (в отсутствии О₂).

Анаэробные условия можно создать следующими методами:

1) физическим

2) химическим

Физические методы

1. Механическое удалениеО₂ с заменой его на инертный газ (в анаэростатах).

2.  Использование специальных жидких питательных сред.

Например, среда Китта-Тароцци, содержащая МПБ, ,5% глюкозы и кусочки печени или мясного фарша , необходимые для адсорбции кислорода.

Перед посевом  кислород из среды  Китта-Тароцци удаляют кипячением, охлаждают, производят  посев материала, после чего  поверхность среды заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

Химические методы

1. Применение поглотителей О₂, таких как щелочной раствор пиргалола на дне эксикатора, в котором на подставку помещают чашки Петри с посевами.

2. Использование «Газпак» - упаковки, содержащей различные химические соединения, способные в результате взаимодействия с Н₂О, связывать О₂ в герметично закрытых ёмкостях, в которые помещают посевы в чашках Петри или пробирках.. Этот метод применяют для выращивания аэротолерантных бактерий.

3. Использование зажженной свечи на дне анаэростата или эксикатора.

Выделение чистых культур анаэробных бактерий

В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур анаэробов используются методы Цейсслера. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Метод Цейсслера

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароцци. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% раствором NаС1. Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, подписывают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.

Второй этап. На следующий день посевы просматривают и описывают характер роста. Приготавливают мазки, окрашивают по Граму. микроскопируют, описывая морфологические и тинкториальные свойства бактеркй. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар, для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат (или в эксикатор, или используют «Газпак »)и термостатируют при температуре 37 "С 18-24 ч.

Третий этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Морфологию бактерий исследуют приготовлением мазка из колонии, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта-Тароцци. Пробирки термостатируют 18-24 часа при температуре 37 "С.

Четвертый этап. Отмечают визуальный характер роста чистой культуры. Проводят проверку чистоты выделенной культуры, для чего ее микроскопируют (чистая культура морфологически и тинкториально однородна).

Биохимические свойства бактерий

Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических. протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь для ах систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий - эндоферменты, другие - экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.

Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название - мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).

У бактерий различают три основные группы ферментов:

1. Конститутивные - постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.

2. Индуцибелъные - синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

3. Репрессибельные - синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Для идентификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто- и токсинообразование.

Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.

Определение сахаролитических ферментов.

Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты, а иногда кислоты и газа.

 Выявление сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в растворе NаОН). В щелочной среде фуксин обесцвечен. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Результаты посевов учитывают через 24-48 часов.

При расщеплении углеводов, вследствие образования кислоты, происходит сдвиг рН в кислую сторону. Цвет среды меняется. Среда Гисса приобретает малиново-красный цвет фуксина. Делают вывод о расщеплении данного углевода до кислоты.

 (Например, глюкоза + К).

 При расщеплении углеводов с образованием кислоты и газа отмечают изменение цвета среды и появление пузырька газа в поплавке. (Напрмер, лактоза + К/Г).

Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, катализирующие расщепление белка

 О протеолитической активности бактерий судят по способности расщеплять белок до газов: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуру засевают на МПБ. Между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород - индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н2S - она чернеет), а на индол - индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола - она краснеет).

Также для определения протеолитических ферментов - коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ.

В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используют системы индикаторные бумажные (СИБ) или мультимикротесты (ММТ).

СИБ - набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры.

ММТ представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета индикаторных дисков (при использовании СИБ) или содержимого лунок (при использовании ММТ) судят о биохимических свойствах культуры.

Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и его цвет используется для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый - микобактерии туберкулеза; сине- зеленый - синегнойная палочка.

Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации.