ЭТАПЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА

ВВЕДЕНИЕ

В современной филогенетике серьезно стоит проблема соотношения морфологических и молекулярных данных.

Вплоть до последней четверти XX века биологи реконструировали эволюционную историю животных преимущественно на основе данных сравнительной анатомии, эмбриологии и палеонтологии. Затем к этому списку добавились молекулярные данные, самыми важными из которых являются нуклеотидные последовательности ДНК. Эволюционные реконструкции («деревья»), основанные на молекулярных данных, не всегда совпадали со старыми «классическими» деревьями. Это приводило к бурным спорам среди зоологов.

Поначалу многие придерживались мнения, что старые проверенные методы надежнее новомодных молекулярных. Но постепенно чаша весов склонилась в другую сторону, и сегодня большинство специалистов считает, что молекулярные данные в принципе позволяют гораздо более точно реконструировать пути эволюции животных, чем морфологические и эмбриологические признаки. В России, правда, до сих пор многие не согласны с этим, но на Западе таких «ретроградов», не доверяющих молекулярным реконструкциям, осталось очень мало.

Современная биология, кажется, уверенно и надежно вооружилась методами молекулярной филогенетики. Морфологические и сравнительно-анатомические изыскания рассматриваются некоторыми молодыми биологами как области, отжившие свой век, а систематиков, продолжающих их использовать, считают отслужившими свою службу узкими специалистами. Зачастую передовая молодежь имеет полное право так считать, потому что во многих случаях данные молекулярной филогенетики выявляют замаскированные конвергенцией расхождения или, напротив, сглаживают чересчур подчеркнутую адаптациями морфологическую разницу.

Так, на основе молекулярного сходства пересмотрена и принята новая систематика членистоногих, вычеркнувшая многощетинковых червей из предков этого типа, уточнены филогенетические связи китов с парнокопытными и многое другое. Если между морфологической и молекулярной филогенетикой обнаруживается нестыковка, то она решается в пользу молекулярного дерева. Молекулярное дерево строится на основе понятных и объективных критериев, экспертные мнения здесь не работают. Кроме того, это методы двадцать первого века, а не замшелого девятнадцатого.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ И ТРАДИЦИОННАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА

Задача филогенетики по сравнению с систематикой намного конкретнее, она конечна – установить родственные связи безотносительно к сходству и различию в целом

Молекулярные методы, включающие анализ нуклеотидных последовательностей, давно и прочно заняли лидирующие позиции в арсенале средств, используемых сегодня в филогенетике и систематике. Тем не менее, настороженное, а порой даже враждебное отношение к их результатам со стороны систематиков, использующих классические морфологические подходы к описанию биологического разнообразия, все еще очень распространено.

Примеров разительных перестроек систематики, произошедших в связи с появлением новых данных по филогении, полученных благодаря применению молекулярных методов, очень много. Им посвящено немало литературы, как в России, так и за рубежом. Интересно, при этом, что и про- тивоположных примеров, когда молекулярные методы великолепно подтверждают высказанные на основании классических данных гипотезы, не только не меньше, но, пожалуй, едва ли не больше. К сожалению, в пылу горячих дискуссий это забывается. Значительная часть российских систематиков все еще продолжает обсуждать молекулярные кладограммы и сравнивать их со своими построениями, не анализируя при этом, как сами эти кладограммы получены, а только с точки зрения того, насколько они совпадают с их ожиданиями.

При анализе морфологических работ трудно представить себе систематика, серьезно обсуждающего разные филогенетические схемы для своей группы без анализа того, на основе каких морфологических признаков они построены, правильно ли установлена гомология и определена полярность признаков, какими синапоморфиями поддержана та или иная клада и т.д. В то же время, очень часто в случае обсуждения работ, выполненных молекулярными методами, систематики классической школы оставляют без внимания важнейшие методические вопросы. Не обсуждается то, какие собственно методики были использованы (секвенирование, рестрикци- онный анализ или другие), какой молекулярный маркер/маркеры анализировали, насколько надежно выравнивание (гомология), каким методом строились кладограммы и многие другие принципиальные моменты в исследовании. Уделяется внимание только результату – рисунку с кладограммой. При этом рисунок рассматривается как окончательное филогенетическое дерево. Здесь хотелось бы отметить основное различие в подходах систематиков классической школы и, условно говоря, «молекулярных филогенетиков» к результату, изображаемому в виде дерева. В работах классической школы, филограммы (деревья), построенные, так называемым «филетическим» методом, суммируют все представления автора о филогении группы на данный момент. То есть построение дерева – финальный этап исследования. В то же время кладограммы, приводимые в молекулярно-генетических схемах – это промежуточный этап работы. Такие кладограммы получаются в результате использования формализованных компьютерных алгоритмов и, как таковые, требуют содержательной интерпретации. Каждая ветвь такого дерева требует дальнейшего тщательного анализа, при этом гипотеза о монофилии каждого узла и даже о его существовании, может быть отброшена как статистически незначимая. Поэтому непосредственно сравнивать молекулярные кладограммы с филогенетическими деревьями, полученными в рамках этих разных методологий некорректно.

СПОРНЫЕ ТАКСОНЫ

Ecdysozoa

Значительные разногласия возникли по вопросу о филогенетическом положении типа Arthropoda. Согласно традиционной точке зрения, происхождение членистоногих от кольчатых червей считалось бесспорным, эти группы часто даже объединяются под названием Articulatа. Единство плана строения Articulata считалось одним из наиболее твердо установленных фактов сравнительной анатомии. Идеи о более тесном родстве трохофорных (аннелид и моллюсков), происхождении нематод от неотенических членистоногих и др. высказывались отдельными авторами, но не имели сколько-нибудь широкой поддержки. Такие филогенетические представления сложились на основе данных сравнительной анатомии, эмбриологии, физиологии, а также сведений об образе жизни этих животных. Но в конце ХХ в. возникла гипотеза, основная идея которой состоит в том, что в самом начале эволюции первичноротых произошла дивергенция на два крупных эволюционных ствола — Ecdysozoa и Lophotrochozoa. К первым были причислены Cycloneuralia (Nematoda, Priapulida и др.) и Arthropoda, а кольчатые черви оказались в числе лофотрохозоев.

Главная и характерная черта экдизозоев состоит в том, что их тело покрыто плотной кутикулой, которая периодически сбрасывается и заменяется новой. Эти линьки осуществляются с помощью особого гормона (экдизона) и под контролем определенных генов. При этом считается, что такие линьки возникли в процессе эволюции только один раз и экдизозои представляют собой монофилетическую группу. Главным доказательством этого признано наличие у всех них SSU rRNA — small subunit 18S рибосомальной кислоты и других молекулярных признаков. А то обстоятельство, что по уровню организации и по плану строения между циклонейралиями и артроподами существует огромный разрыв, сторонников экдизозойной гипотезы почему-то не смущает. Не менее пестрая компания объединена в кладе Lophotrochozoa, в который попали те первичноротые, которым линьки не свойственны (Platheminthes, Mollusca, Annelida, Lophophorata и др.). Это свидетельствует о независимом возникновении метамерии в эволюции животных. Также из этого следует, что целом, который специалисты по сравнительной анатомии считали надежнейшим таксономическим признаком (основой для естественной классификации), в действительности развился независимо у первичноротых и вторичноротых.

Articulata как таксон в традиционной системе объединяет:

– сходный набор и взаиморасположение основных органов внутреннего и наружного строения, в том числе придатков предротовой лопасти и сегментов тела;

– малосегментные личинки метатрохофора и науплиус (или соответствующие им эмбриональные стадии) с предротовой и анальной лопастью, ларвальным телом и зоной роста;

– сходные по положению личиночный теменной орган и науплиальный глаз (несмотря на

спорность их гомологии ввиду парной закладки последнего);

– принципиально сходное устройство нервной системы, включающей: окологлоточное нервное

кольцо с надглоточным ганглием (который принято гомологизировать с первичным мозгом, хотя

интерпретация – это не особенность строения) спарными грибовидными телами и нейромеры с

однотипными парными брюшными ганглиями, коннективами, комиссурами, боковыми нервами;

– спинное сердце;

– связанные с диссипиментами нефридии;

– отсутствие признаков других типов (ортогональной нервной системы, не включенного в

надглоточный ганглий осевого нервного центра и статоциста, развитой паренхимы, ктенидиев, диссимметрии целомов)...

С морфологической точки зрения в экдизойной гипотезе особенно режет глаз решительное отрицание эволюционной преемственности между аннелидами и артроподами, и сближение последних с циклонейралиями. Критические замечания по поводу этой гипотезы были опубликованы разными авторами, но широкого обсуждения экдизозойной гипотезы в литературе не было. Тем не менее, эта гипотеза получила широкое признание и приводится во всех учебных руководствах, как азбучная истина.

Iguania

Джон Вайенс из Университета штата Нью-Йорк в Стони-Бруке и его коллеги опубликовали статью, в которой обсуждается вариант филогенетического дерева, построенного на базе 44 ядерных генов, определенных у 161 вида ящериц, змей и игуан. В качестве внешней группы рассматривались гаттерии. Это самая близкая, но всё же отдельная эволюционная линия клювоголовых рептилий. Кроме гаттерий авторы примерили к своему дереву и другие внешние группы — мышь, человека, черепах и крокодилов. На обобщенном молекулярном филогенетическом дереве наиболее примитивными представителями чешуйчатых оказываются вовсе не игуаны, как утверждала классическая точка зрения. Напротив, игуаны, или, точнее, игуанообразные, заняли вполне прочное (с точки зрения статистики, конечно) положение среди весьма специализированных змей и веретеницеобразных (Anguimorpha).

Этому дереву противопоставляется другое, выполненное мастерами сравнительной анатомии, использовавшими для построения дерева морфологические признаки. Возглавлял команду зоологов Жак Готье (Jacques A. Gauthier) из Йельского университета. Их данные также выглядели на редкость впечатляюще: 192 тщательно отобранных вида, из которых 51 вымерший и 141 существующий ныне. У этих видов изучены 610 фенотипических признаков, распределенных по 976 точкам ветвления филогенетического древа. Внешней группой зоологи и в этом случае выбрали гаттерию. Также, как и в молекулярном дереве, была построена кладограмма сходства организмов, обладающих конкретными наборами признаков. Многие из этих признаков анализировались впервые, так как оказались доступны только благодаря использованию томограмм черепов.

Лейтмотивом этого исследования был вопрос: могут ли новые уточненные и расширенные данные по морфологии разрешить «игуановый конфликт», хоть как-то согласовать неожиданно высокое положение внешне примитивных игуан на эволюционном дереве чешуйчатых? Всё же их примитивные признаки, такие как цельный язык, используемый для ловли добычи, превосходное зрение и неразвитое обоняние, территориальность самцов, — отправляют игуан в начало филогенетического дерева.

Несмотря ни на что, старое морфологическое дерево не разрушилось, не изменилось, а, напротив, стало еще крепче. Игуаны, как и в прежних, классических схемах, поместились в стволе филогенетического дерева чешуйчатых. Свои примитивные признаки они, как показывает это дерево, унаследовали от общего с гаттериями предка. Змеи и веретеницы отправились в высокие ветви филогенетического древа, где они делят с другими ящерицами специализированные признаки: раздвоенный язык, используемый для активной пищедобывательной стратегии, когти, участвующие в поимке добычи, отсутствие территориальности, сильно развитые обонятельный и вомероназальный органы, специализированное сочленение челюстей с черепом и так далее.

Если принять молекулярную филогению, то придется признать, что эволюция повернула вспять, чтобы произвести игуан. Слишком уж много получается реверсий — возвратов к примитивным чертам. И слишком много у игуан оказывается потерянных по ходу развития продвинутых черт, причем из разных функциональных морфологических блоков. Нужно учитывать, что есть еще и данные онтогенеза, и данные по ископаемым формам. И все они поддерживают морфологическое филогенетическое древо, а не молекулярное.

ЭТАПЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА

Очень часто, обсуждая и сравнивая недостатки и достоинства морфологического и молекулярного подходов к анализу филогении, много говорят о роли интуиции, о субъективности первого и о якобы объективности второго, не зависящего от личностного опыта исследователя. В упрощенном виде эти противопоставления сводятся к следующему: только хорошо знакомый с группой систематик может найти и выделить надежные морфологические признаки, несущие филогенетический сигнал. В случае молекулярного подхода, мол, это неважно, любой, даже совсем незнакомый с группой исследователь может получать и анализировать сиквенсы и строить филогении. Такие аргументы равно используют как «за» так и «против» сторонники обоих подходов. На объективности и субъективности в молекулярно-филогенетическом анализе стоит остановиться особо именно из-за широко бытующего мнения, что он объективен и не зависит от опыта исследователя. Но это не совсем верно, и при молекулярно-филогенетическом анализе данных субъективность всегда существует. Этот подход также требует экспертного знания и не в меньшей степени, чем при анализе морфологических признаков. Для того чтоб это проиллюстрировать, остановимся на этапах моле- кулярнофилогенетического анализа. 1. Первый этап – постановка задачи и сбор данных. Данный этап принципиально мало, чем отличается от такового при любом другом исследовании. Очень важно подчеркнуть, что именно на этом этапе формулируется филогенетическая гипотеза, которую предполагается тестировать молекулярными данными, формулируется вопрос исследования. От того, насколько корректно и грамотно он сформулирован и как поставлена задача, в наибольшей степени, зависит и конечный результат исследования. И точно так же здесь нельзя обойтись без опоры на общий опыт и предыдущее знание о группе. Зависимость от личного опыта и интуиции очень сказывается на этом этапе и в молекулярно-генетических исследованиях. Именно на этом этапе определяется состав и размер выборки для анализа, подбираются молекулярный маркер/маркеры (задача, сопоставимая с отбором признаков в морфологическом анализе), подбираются таксоны внешней группы. От всех этих параметров очень зависит результат, но сам их выбор как раз и опирается на личный опыт и предыдущее знание. Поэтому на хороший результат рассчитывать можно только в случае, когда исследователь хорошо знаком с обсуждаемой группой. 2. Следующий этап – работа в лаборатории. Здесь происходит выделение ДНК из образцов, постановка ПЦР (полимеразная цепная реакция), секвенирование. Причем не все эти процессы могут проходить в одной лаборатории. Сегодня, как правило, большинство исследователей отправляют свои образцы с ПЦР–фрагментами (или клонированными продуктами) для секвенирования в специализированные центры. На этом этапе работа действительно очень регламентирована лабораторными протоколами и может выполняться высоко- квалифицированным техническим персоналом (которому часто и поручают такую работу). Только к этому этапу может относиться вышеприведенное заявление о том, что любой, даже совсем незнакомый с группой исследователь, может получать сиквенсы. Это высказывание справедливо еще и по той причине, что приобретение навыков лабораторной работы сегодня происходит очень быстро, тогда как все хорошо знают, что становление «хорошего» систематика, приобретение опыта морфологического исследования, умение видеть и работать с морфологическими признаками – процесс очень длительный. Однако уже на следующем этапе анализа данных экспертное знание снова потребуется и если исследователь владеет только навыками лабораторной работы, то вряд ли можно будет рассчитывать на удовлетворительный результат. 3. Выравнивание. При работе с последовательностями ДНК в качестве отдельных признаков выступают конкретные нуклеотидные позиции (сайты) по всей длине изучаемого фрагмента, а нуклеотиды (А, Т, Ц, Г) соответствyют состояниям признака. А поскольку любой метод филогенетического анализа предполагает сравнение гомологичных признаков, то и в данном случае необходимо правильно установить гомологию признаков. Достигается это процедурой выравнивания. Иными словами, выравнивание нуклеотидных/аминокислотных последовательностей это – не что иное, как определение позиционной гомологии. И так же, как при анализе морфологических признаков, ошибка в гомологии приведет к неверному результату, а именно множественное выравнивание подается на вход филогенетическим компьютерным программам и от выравнивания напрямую зависит, какое в итоге будет получено дерево. Выравнивание может быть достаточно простой процедурой, если работа идет с близкими таксонами и к тому же известно априори, что делеции и вставки отсутствуют, как, например, в белок-кодирующих митохондриальных генах. Достаточно легкая процедура выравнивания – одна из причин большой популярности использования митохондриальных генов в качестве филогенетических маркеров. Фактически, на таком выравнивании мы видим только примеры точечных замен. Ситуация значительно осложняется, когда, наряду с точечными мутациями, встречаются вставки и делеции (ситуация более чем обычная при работе с ядерными генами и некодирующими последовательностями). Несмотря на то, что выравнивание последовательностей всегда проводят с использованием компьютерных программ, экспертное знание на этом этапе совершенно необходимо и ответственность за принимаемую гомологию невозможно переложить на компьютер. Останавливаясь на этапе выравнивания, нельзя не сказать несколько слов о молекулярном маркере (фрагмент ДНК, по которому ведется анализ). Очевидно, что при выборе маркеров, в значительной степени, присутствует та же проблема, что и при поиске надежных морфологических признаков. Довольно часто исследователей упрекают в интуитивности и субъективности выбора «надежных» признаков, на которых основываются филогенетические гипотезы. Выбор молекулярных маркеров с сильным филогенетическим сигналом – задача не более легкая, чем при работе с морфологическими признаками решается столь же субъективно. Результаты, основанные на использовании различных маркеров,

часто вступают в конфликт. Одно из возможных решений – увеличение числа анализируемых маркеров. Сегодня уже редко серьезно обсуждаются работы, выполненные только на одном маркере. Но просто увеличивать число случайно выбранных маркеров (а работа с геномом дает такую возможность) – не самый надежный и быстрый путь добиться хорошего результата. Тщательный выбор маркеров помогает проводить полученное выравнивание. По матрице выровненных последовательностей уже можно увидеть и оценить такие важнейшие параметры, как вариабельность маркера (достаточно ли информативных замен), есть ли смещение в процентном содержании нуклеотидов, использовании кодонов, провести тесты на насыщение (наличие множественных замен в одном сайте) и, таким образом, оценить перспективы его использования в целях реконструкции филогении. Однако, чтобы проводить такой отбор маркеров, необходимо не только владеть навыками работы с последовательностями и программами, но и, безусловно, хорошо знать таксоны, филогению которых предполагается реконструировать, владеть всем арсеналом методов

классической зоологии. 4. Построение деревьев. После того, как получено выравнивание, наступает следующий этап – проведение собственно филогенетического анализа: выбор моделей и реконструкция филогении по различным алгоритмам (максимальной экономии, максимального правдоподобия, Баесова анализа) в соответствующих программных пакетах. Данный этап исследования заканчивается получением соответствующих деревьев, построенных разными методами и для разных маркеров, а также и при объединении всех маркеров в один массив (конкатенированная матрица). Еще раз подчеркну, что в работах эволюционных филогенетиков – полученное дерево – это последний этап филогенетического анализа, суммирующий представления исследователя об эволюции группы. В молекулярно-генетических

исследованиях вслед за этим этапом наступает следующий очень важный этап – оценка получен ных деревьев. 5. Оценка достоверности полученных деревьев. Использование различных алгоритмов анализа в результате может привести к деревьям, различающимся по топологии, но вполне вероятна и ситуация, когда все использованные методы дадут дерево с одной топологией.

В любом случае, возникает вопрос о том, насколько достоверна топология полученного дерева. Для оценки достоверности узлов дерева используются различные статистические подходы. Два самых

распространенных: бутстреп-оценка (bootstrap) основан на методе повторных выборок (resampling) и апостериорная вероятность (posterior probabilities – PP) дерева или его узлов в рамках

Баесова подхода. Эти цифровые значения всегда приводятся в работах с молекулярными деревьями над ветвями около соответствующих узлов. Чем выше эти значения – тем надежнее поддержана гипотеза о монофилии соответствующего узла. Как правило, считается бессмысленным обсуждать кластеры, поддержанные бустреп значением менее чем на 50% и с апостериорной вероятностью менее 0.9. Индексы ниже этого

порога обычно не указываются на деревьях. Надо сказать, что в качестве порога «надежной» поддержки общего мнения не существует, и разные авторы выбирают разные значения. Но, высокие

бутстреп–поддержки ни в коем случае не говорят о том, что полученное дерево обязательно отражает «истинные» филогенетические связи, доказывают монофилию группы. Бутстреп–оценки не исправят ошибки, допущенные в ходе исследования (выравнивания, неадекватный молекулярный маркер, алгоритм анализа, неверный выбор внешней группы и т.д.), поэтому доверять дереву, опираясь только на высокие бутстреп–оценки, без учета всех остальных данных – опасно. Рассмотрим пример по изучению филогении грызунов подсемейства полевочьих.

Заботы по анализу молекулярной филогении скальных полевок (Alticola) проводилась с использованием маркера митохондриального гена – цитохрома б. При использовании всех алгоритмов филогенетического анализа получили деревья с одной топологией и высокими бутстреп–поддержками (рис1).Согласно полученному результату, род лесных полевок (Myodes=Clethrionomys) оказался парафилитичным относительно скальных полевок (Alticola), а сами скальные полевки полифилитичной группой. Кроме того, один вид из рода скальных полевок – большеухая полевка (A. macrotis)

оказалась очень близка к одному из видов лесных полевок (дистанции, сопоставимые с подвидовым уровнем). Проведенный позднее анализ нескольких ядерных генов убедительно показал монофилию рода скальных полевок (Рис. 1б). Вероятнее всего, первый результат связан с давней гибридизацией большеухой и лесной полевок и последующей интрогрессией. Данный пример показывает, как опасно делать выводы о филогении группы и переводить их в таксономические схемы, опираясь только на один маркер, даже если получены высокие статистические поддержки узлов на дереве. В случаях, когда в результате молекулярно-филогенетического анализа полученное дерево резко противоречит всем остальным данным (морфологическим, палеонтологическим и др.) и при этом узлы имеют высокие статистические поддержки, не имеет смысла решать голосованием,какое лучше, или брать на веру одно из них. Сравнивать надо не филогенетические кладограммы, а качество исходных данных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современная биология, кажется, уверенно и надежно вооружилась методами молекулярной филогенетики. Сегодня все большее распространение получают исследования с включением в анализ большого количества генов. Конечно, надежность выводов, основанных на согласованных результатах по независимо эволюционирующим маркерам, значительно повышается. При этом темпы развития методов секвенирования и аналитических инструментов дают надежду, что многие трудности, которые испытывает молекулярная филогенетика сегодня, будут преодолены уже в недалеком будущем. Вместе с тем, я с большим скепсисом отношусь к заявлениям о конце филогенетике, как науки. Даже если оставить в стороне другие аргументы, существует проблема вымерших видов, а современное разнообразие лишь маленький осколок таксономического разнообразия организмов, существовавших в прошлые геологические эпохи и связанных родством с ныне существующими. Даже если отказаться от идеи построения единой филогении современных и вымерших организмов, а ограничиться только задачей реконтрукции филогении для современных форм, то полученная филогения все равно останется только гипотезой. Кроме того, хорошо

известно, к каким артефактам может приводить неполнота таксономической выборки при проведении молекулярно-генетического анализа. Но к палеонтологическому материалу неприменим (кроме позднеплейстоценовых остатков), и вряд ли когда-либо будет, применим молекулярный подход. Это, кроме всего прочего, еще один аргумент в пользу того, что морфологический метод никогда не потеряет своей актуальности.

Я не сомневаюсь в том, что время эмоциональных обсуждений на тему, какая филогения лучше – « морфологическая» или «молекулярная», – давно прошло. Подобные малоконструктивные дебаты должны смениться скрупулезным анализом возможных причин противоречий, технических и методических ограничений и возможностей каждого из подходов, непростых моделей, методов и вариантов статистической обработки и оценки надежности полученных результатов филогенетического анализа, как при работе с морфологическими, так и с молекулярными данными.

Развитие методов филогенетики и систематики связывают все более с интегративным подходом с обязательным включением как морфологических (в самом широком плане), так и молекулярных данных с перекрестной проверкой результатов при тестировании и формулировке филогенетической гипотезы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрамсон Н. И. Молекулярная и традиционная филогенетика. На пути к взаимопониманию //Труды Зоологического института РАН. – 2013. – Т. 317. – №. Приложение 2. – С. 219-229.

2. Лухтанов В. А., Кузнецова В. Г. Молекулярно-генетические и цитогенетические подходы к проблемам видовой диагностики, систематики и филогенетики //Журнал общей биологии. – 2009. – Т. 70. – №. 5. – С. 415-437.

3. Лухтанов В. А. От Геккелевской филогенетики и Генниговской кладистики к методу максимального правдоподобия: возможности и ограничения современных и традиционных подходов к реконструкции филогенезов // Энтомологическое обозрение. - LXXXXIX, 1 - 2010. - C. 133-149.

4. Наймарк Е. Игуаны голосуют против молекулярной филогенетики // Новости науки. - 2012.

5. Алёшин В. В. Филогения беспозвоночных в свете молекулярных данных: перспективы завершения филогенетики как науки //Труды Зоологического института РАН. – 2013. – Т. 317. – №. Приложение 2. – С. 9-38.