Обсуждение результатов исследования

3.1 Ингибиторный анализ токсических соединений

Во многих сферах деятельности человека возникает необходи­мость анализа и контроля содержания токсических соединений в раз­личных объектах. В частности, решение таких задач важ­но для обнаружения боевых отравляющих веществ, в производстве для соблюдения техники безопасности и промсанитарии, при контро­ле атмосферы промзоны и т.д. В последние годы появилась глобаль­ная задача контроля состояния и ООС, сущест­венные изменения которой связаны с все ускоряющейся индустриаль­ной деятельностью человека. В связи с этим в нашей стране принят ряд законодательных актов и систематически проводится работа по повышению качества компонентов ОС, прежде всего ат­мосферы и гидросферы, и совершенствованию методов ее контроля. В области биологического и химического контроля состояния ОС существует две основные задачи. Первая состоит в обна­ружении загрязнений ОС, которые отрицательно влияют на биосферу.

Однозначным тестом на такое загрязнение является патологическое ее воздействие на биоорганизм. Чаще всего только в случае обнаружения такого влияния целесообразно решение более сложной задачи - определение химической природы соединений, вызы­вающих патологическое воздействие (идентификация токсических сое­динений), и источников загрязнения ОС. Решение этой задачи предусматривает наличие суммы аналитических методов обнару­жения большого числа токсических ингредиентов [130]. В настоящее время наметилось отставание в решении первой задачи при относи­тельно быстром возрастании числа индивидуальных токсических ингредиентов, поддающихся аналитическому контролю. Такое положение соответствует сложившейся системе оценки качества атмосферного воздуха и вод, основным и единственным критерием которого является предельно допустимые концентрации (ПДК) индивидуальных веществ и их комбинаций [130].

Такое узкое понимание проблемы контроля ОС, подразумевающее, что разработка аналитических методов обнаруже­ния официально утвержденных токсических компонентов автоматичес­ки снимает с повестки дня первую задачу, в настоящее время в кор­не не верно. Во-первых, разработка, тем более техническая реали­зация методов обнаружения всей гаммы токсических ингредиентов, требует чрезвычайно больших затрат. Учитывая, что список токси­ческих компонентов постоянно пополняется, а интенсивная индустриальная деятельность человека приводит к появлению в ОС все новых и новых компонентов, следует признать, что разви­тие только этого направления не способно угнаться за требования­ми в области ООС. Это относится в полной ме­ре и к вновь создаваемым потенциальным противником боевым отрав­ляющим веществам с неизвестной для нас структурой и физико-химическими свойствами. Следует также отметить, что решение чисто аналитической задачи по отдельным компонентам и даже их комбина­циям не позволяет однозначно предсказать интегральное токсическое воздействие на биосферу. К тому же экономически нецелесообразно постоянно привлекать весь дорогостоящий арсенал аналитичес­кой химии по всем точкам контроля без предварительного теста на общую токсичность. В связи с вышесказанным очевидна необходимость быстрейшего решения задачи создания технически совершенных тес­тов обнаружения общей токсичности различных объектов окружающей среды, которые в отличие от чисто биологических методов отлича­лись бы быстротой и высоким уровнем автоматизации. В связи с этим следует обратить внимание на возможности ингибиторного фер­ментативного метода анализа для обнаружения токсических соедине­ний различного происхождения в ОС и проведении комплексной экологической экспертизы.

Учитывая механизм воздействия токсических соединений на биологические объекты, в большинстве случаев связанные с ингибированием метаболитических превращений в клетках, контролируемых фер­ментами [131], можно прийти к выводу о целесообразности в качест­ве аналитического сигнала при определении различных токсичных со­единений использовать ингибирующее действие этих соединений на ферментативные системы. Используя ключевые ферменты, контролиру­ющие важнейшие метаболитические пути, можно создать физико-химический анализатор для количественного дифференциального и интег­рального определения различных типов ядов, токсичных веществ и их смесей. В конечном счете, используя мультиферментные системы, катализирующие широкий набор параллельно и последовательно идущих реакций, можно разработать автоматический анализатор, достаточно точно моделирующий суммарное воздействие загрязнений атмосферного воздуха или воды на биологические объекты и тем самым дающий ре­зультат определения токсичности, однозначно коррелирующийся с воз­действием на биосферу. Преимуществом такого анализатора является возможность его использования в едином аппаратурном оформлении для анализа широкого набора индивидуальных токсических веществ и выполнения общей экологической экспертизы, для чего потребуется только замена используемых реагентов.

По своей сути предлагаемый метод определения токсических ве­ществ и общей токсичности относится к кинетическим методам коли­чественного анализа с использованием катализаторов, являющимся от­носительно новой областью аналитической химии [132,133].

Функционирование ферментативного анализатора в режиме непрерывной подачи ингибитора. Блок-схема ферментативного проточного анализатора токсичности приводится на рис.6. Возраста­ние продукта реакции в растворе, вследствие протекания ферментатив­ного процесса, регистрируется потенциометром (6). При определении продукта реакций фоновая линия совпадает с осью на диаграмме рис.7. Вид кривой на диаграмме мож­но объяснить тем, что в результате ферментативной реакции, проте­кающей в капиллярном реакторе, происходит превращение субстрата, вследствие чего на выходе из реактора фоновая концентрация  уменьшится до  (рис.7 а,б). При вводе в поток фермента токсического вещества происходит ингибирование биокаталитической реакции, в связи с этим концентрация субстрата на выходе из реактора возрастает относительно фоновой линии до уровня . Это увеличение  является однозначной функцией концентрации ингибитора в потоке  и может служить в качестве аналитического сигнала.

Рисунок 6 -Схема проточного ферментативного анализатора.

1 - капилляры для подачи фермента (Е), субстрата (S), ингибитора (i),

2- перистальтический насос, 3- смеситель,

4- термостатируемый реактор, 5- детектор, 6- потенциометр

Рассмотрим теорию функционирования вышеописанного анали­затора. Подробный обзор современного состояния теории функционирования проточных, в том числе и аналитических, фермен­тативных реакторов представлен в работе [134]. В то же время следует отметить, что теории проточного ингибиторного анализа на­ми в литературе не обнаружено.  

Рисунок 7 - Диаграмма регистрации продукта ферментативной реакции

при непрерывной (а)и импульсной (б) подаче ингибитора (i)

Согласно [134] концентрированное по­ле субстрата в проточном реакторе с учетом продольной дисперсии описывается уравнением:

                  (1)

где: Cs = [S] концентрация субстрата, t – время, U-линейная скорость потока, X - расстояние вдоль реактора,Ds - эффективный коэффициент диффузии, характеризующий продольное размывание, r - объемная скорость реакции.

При описании непрерывных динамических методов анализа, в которых реагенты и анализируемый раствор непрерывно подаются в проточный реактор, в случае, когда концентрация анализируемого компонента меняется плавно, можно пренебречь продольным размыва­нием и использовать вместо (1) уравнение:

                                (2)

В случае стационарного состояния, которое имеет место при смеше­нии потоков постоянного состава, справедливо более простое урав­нение:

             (3)

В предельном случае субстрат и продукт реакции движутся совмест­но с линейной скоростью потока без размывания и время пребыва­ния всех компонентов реакционной смеси одинаково и равно:                           

  (4)

где: L - длина трубчатого реактора.

Что касается концентраций субстрата и продукта на выходе из реактора, определяющих чувствительность метода, то они равны концентрациям, которые имеют мес­то при проведении процесса в статических условиях с перемешива­нием, U-линейная скорость потока. При этом проточный реактор выполняет роль транспортера ре­акционной смеси и устройства, задающего время инкубации, равное t*. Следовательно, в этом случае теория аналитического сигнала может базироваться на кинетике ферментативного процесса без уче­та динамических эффектов.

3.2 Исследование электроферментативного анализатора токсичности, включающего предреактор

Проточный анализатор с предреактором был использован при разработке макетной установки, пред­ставленной на рис. 8.

Рисунок 8 - Схема проточного электроферментативного анализатора токсичности,включающего предреактор

1 - перистальтический насос, 2 - цредреактор, 3 - дозатор,

4 - реактор, 5 - электрохимический проточ­ный детектор, 6 - универсальный полярограф

Перистальтическим насосом (1) в термостируемый фторопластовый предреактор (2) подавали буферный раствор (БР), ацетилхолинэстеразу (Е), дозатором (3) вводили модельный ин­гибитор прозерин в количестве от 10 до 50 мкл. Время нахождения фермента с ингибитором в предреакторе составляло около 5-6 мин. После прохождения предреактора смесь поступала в реактор (4), где и происходило ее смещение с раствором ацетилхолинйодида (S). Ре­гистрацию тиохолинйодида осуществляли в электрохимическом детекто­ре при потенциале 0,4 В (н.к.э.), типичный профиль кривой при за­писи работы анализатора приводится на рис. 9.

Рисунок 9 - Характер записи аналитического сигнала при определенииконцентрации прозерина: 1-1∙10^-3и 2-1∙10^-4 мг/мл

Перед введением в предреакторхолинэстеразы предварительно производили запись сиг­нала тока, связанного с окислением тиохолинйодида, образующегося в результате самопроизвольного гидролиза ацетилтиохолинйодида в процессе хранения субстрата. При введении в предреактор фермента по истечении примерно 10 мин начиналось формирование фоновой ли­нии Р_ф. Столько же времени было необходимо для проявления сигнала тока, указывающего на действие ингибитора, вызывающего инак­тивацию биокатализатора в аналитической системе.

На рис.9 приводится запись регистрации прозерина с концентрациями 10^-3 и 10^-4 мг/мл. Получено, что с уменьшением на порядок количества вве­денного прозерина величина аналитического сигнала падает в 4 ра­за. Полный вывод пробы ингибитора из реакторов анализатора завер­шается по истечении 5 мин. Учитывая, что полный промежуток време­ни, необходимый для анализа пробы, составляет 15 мин, можно за­ключить, что образец ингибитора размывается в реакторах аналити­ческой системы на 1/3 их суммарной длины. Следует обратить внима­ние на дрейф исходной фоновой линии (Р_ф), вызванной, вероятно, пассивацией платинового электрода, частичной инактивацией исход­ного раствора фермента, сорбцией фермента на стенках капиллярных реакторов.

В связи с последним проводились исследования изменения аналитического сигнала во времени при регистрации тиохолинйодида на платиновом электроде (рис.10). Наиболее значительный дрейф фоновой линии наблюдался в течение 2-3 часов непрерывной эксплуатации датчика, а уже затем происходила относительная стабилиза­ция аналитического сигнала. Кроме того, последний зависел от температуры проведения анализа: при 4 °С за пять часов работы анали­затора сигнал тока уменьшался лишь на 23 %, тогда как при 20 °С - на 46 % относительно исходного фонового сигнала тока. Надо отме­тить, что температура существенно влияет и на работу электрофер­ментативного анализатора токсичности. Получены данные определе­ния прозерина с концентрацией 10^-4 мг/мл при 25 и 37 °С. При 37°С аналитический сигнал возрастал на 44 % относительно его величины при 25 °С.

Рисунок 10 - Кинетическая зависимость изменения анали­тического сигнала при регистрации тиохолинйодида на платиновом электроде (1-4 °С и 2-20 °С)

Условия эксперимента: C_E = 1,0 мг/мл, Сs=1,44∙10^-3 моль/л,

время ферментативной реакции 3,5 мин.

При оптимизации работы анализатора в зависимости от концен­трации ацетилхолинэстеразы было получено, что в условиях анализа, приведенных в подписи к рис.9, следует использовать АХЭ с концентрацией 2∙10^-2 мг/мл и с удельной активностью 2 Е/мг.

Рисунок 11 - Зависимость сигнала тока от длины предреактора при определении:1 - хлорофоса (С₁=10^-1 мг/мл), 2 – прозерина

(C₁ = 3,74·10^-4 мг/мл).

Условия эксперимента: C_E=3,33·10^-2 мг/мл, C_s=5,85·I0^-4 моль/л,

время ферментативной реакции - 2 мин, объем вводимой пробы

ин­гибитора 10 мкл. Растворы приготавливали в 0,015 М фосфатном

буферном растворе с ph=7,5, содержащем 0,1 н хлорид натрия

и 1·10^-3 моль/л йодида калия

Изучая изменение величины сигнала от длины предреактора при определении прозерина с концентрацией 3,75∙10^-4 мг/мл и хлорофо­са - 1∙10^-1 мг/мл (рис.11), установили, что для этих двух ингибиторов длина предреактора должна быть чуть более 100 см.

Рисунок 12 - Градировочная характеристика аналитического сигнала от концентрации прозерина (импульсный ввод).

Условия эксперимента: С_E=3,3·10^-2 мг/мл, С_S =5,85·10^-4 моль/л,

длина реактора 2,2м., время ферментативной реакции 4,5 мин,

объем вводимой пробы 10 мкл

Из приведенной на рис.12градуировочной характеристики для определения прозерина можно сделать вывод, что разработанный метод по­зволяет устойчиво определять концентрации ингибитора в диапазоне 10^-4-10^-3 мг/мл.

Заключение

В представленной дипломной работе осуществлен сбор информации и проведен анализ текущего состояния ЭАК в Республике Казахстан. Детально изучены существующие проблемы ЭАК в области правовой регламентации, нормативно-технического, методического, метрологического, а также аппаратурного обеспечения.

В результате анализа состояния правовой регламентации было установлено, что принятые нормативные правовые акты, регулирующие отношения в области охраны ОС и ЭАК, не противоречат основным документам: Экологическому и Водному Кодексам Республики Казахстан.

Следует отметить, что ряд задач, намеченных в «Концепция развития эколого-аналитического контроля в области охраны ОС в Республике Казахстан на 2005 - 2007 гг. (Приказ Министра охраны окружающей среды РК от 02.02.2005 г. № 32-п), были выполнены не полностью. В этой связи в настоящее время требуется усовершенствование ЭАК в соответствии с текущими сложившимися условиями в РК.

Нормативно-техническое обеспечение и правовая регламентация, разработаны в системе Министерства охраны ОС РК и Министерства здравоохранения РК, а также в ряде отраслевых и научных институтов в области охраны ОС.

К наиболее важным нормирующим документам ЭАК относят: предельно-допустимые концентрации (ПДК), разработанные для индивидуальных веществ; санитарные правила и нормы (СанПиН); гигиенические нормативы (ГН); нормы радиационной безопасности СанПиН № 565 от 29.07.2010г. (НРБ-99). Кроме того, на территории Казахстана используется нормирующий документ, получивший название ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ).

Для действующих предприятий нормирование ЗВ производится путем установления нормативов предельно-допустимых выбросов (ПДВ) в атмосферу и нормативов предельно-допустимых сбросов (ПДС) в водные объекты, на поля фильтрации, пруды-испарители. Нормативы ПДВ и ПДС утверждаются территориальными природоохранными органами с учетом замечаний органов Госсанэпиднадзора. Методическое обеспечение ЭАК в Казахстане имеет аббревиатуры: СТ РК ИСО, ГОСТ Р ИСО, ПНД Ф, РД, МИ, МР, МУК.

Согласно закона РК "Об обеспечении единства измерений" методики выполнения измерений (МВИ), применяемые при аналитическом контроле и мониторинге, должны быть метрологически аттестованы и внесены в Государственный Реестр (ГР) МВИ РК. В этой связи используемые международные стандарты и национальные стандарты зарубежных государств также должны проходить обязательную учетную регистрацию в РГП "Казахстанский институт метрологии".

Следует отметить сложную ситуацию с ввозимыми на казахстанский рынок зарубежных и российских высокоточныхсовременных средств измерений, т.к. их применение на территории РК правомочно только после их внесения Государственный реестр СИ РК. Дилеры ведущих зарубежных фирм-производителей СИ зачастую вносят их в ГР СИ РК, но без их привязки к методическому обеспечению, т.е. к МВИ и это связано со значительным количеством используемых МВИ при проведении ЭАК в РК.

 Для проведения правомочного ЭАК в РК в обязательном порядке необходимо совместно и параллельно решать эти две взаимосвязанные задачи, т.е. требуется одновременное использование МВИ, внесенных в ГР МВИ РК, в обязательной привязке с применяемыми к ним СИ, также внесенных в ГР СИ РК, что требует значительных временных и финансовых затрат для казахстанских эколого-аналитических служб.

В вышеупомянутой «Концепции ЭАК в РК…» планировалось создание метрологической службы (МС) при МООС РК, которая централизованно осуществляла бы проведение работ по гармонизации нормативных документов в области ЭАК РК с международными и национальными стандартами других государств. Метрологическая служба должна была бы осуществлять целенаправленную координацию работ по метрологическому обеспечению единства и требуемой точности результатов измерений, контроль достоверности эколого-аналитической информации о состоянии ОС, внедрения современных методов и средств измерений при проведении ЭАК, принимать непосредственное участие при проведении аккредитации эколого-аналитических лабораторий.В Казахстане действуют 115аккредитованных лабораторий в области охраны ОС, отвечающих требованиям СТ РК ИСО/МЭК 17025-2001 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

В соответствии с Технической спецификацией в дипломе описаны существующие в мире концепции ЭАК, использующие современные образцы аналитического оборудования. В рамках международных соглашений Казахстан признает нормативно-методологические документы в области ЭАК и мониторинга, разработанные в бывшем СССР, а также в РФ, но при условии прохождения в установленном порядке процедуры признания их правомочности на территории РК.

В связи с этим была рассмотрена существующая нормативно-техническая и правовая регламентация ЭАК, а также методическое, метрологическое и аппаратурное обеспечение, которые были представлены 807 наименованиями методик и документов.

Исследование правовой, а также нормативно-техническойдокументации, регламентирующей ЭАК показало, что ряд документов разработаны в системе Казгидромета, другие - в системе по водным ресурсам, в рамках Казэпиднадзора и т.д. Ведомственная разобщенность выявила отрицательное влияние существующей в Казахстане системы разработки нормативно-технических документов для выработки общей государственной политики в области ЭАК.

Рассмотрен вопрос о целесообразности проведения предварительного биотестирования сложных смесей ЗВ в объектах ОС на суммарную токсичность.

Преимуществами предварительного биотестирования является:

- возможность обнаружения и определения суммарной токсичности неизвестных отравляющих веществ с неустановленной структурой и физико-химическими свойствами;

- экономическая целесообразность применения предварительного биотестирования до процедуры использования в ЭАК дорогостоящего химико-аналитического оборудования и затратного по времени проведения химанализа с учетом, зачастую, сложной предварительной пробоподготовки.

При проведении предварительного биотестирования используется принцип воздействия токсических веществ на люминесцирующие бактерии Photobacteriumphosphoreum, который заложен в основу работы приборов Микротокс 5ТМ (Beckman, США) и Биотокс-10М (Россия).

Другим перспективным биотестом, показывающим на присутствие токсических веществ в объектах ОС, может быть ингибирование ферментативных реакций. Ферментативные методы анализа обладают групповой специфичностью, высокой чувствительностью, обеспечивая определение токсичных веществ в диапазоне концентраций от 10^-4 до 10^-7 мг/мл., время отклика аналитической системы от 15 до 30 сек.

В дипломной работе рассмотрены принципы ингибиторного анализа токсических соединений, описываются существующие ферментативные методы анализа ЗВ, а также приводится перечень промышленных биосенсоров, используемых в ЭАК. Принцип действия ферментативных анализаторов основывается на ингибировании биоката­литических систем токсичными веществами. Были разработаны проточные электроферментативные анализаторы токсичности на основе фермента холинэстеразы. Анализаторы в качестве основного узла включали ферментативный реактор и ре­гистрирующий блок, фиксирующий кинетику протекания ферментативных процессов. Для проточных ферментативных анализаторов нами была разработана теория ингибиторного ферментативного анализа. Были изучены закономерности изменения величины сигнала в ферментативной аналитической системе в зависимости от условий проведения анализа и концентраций ЗВ. Разработана схема проточного анализатора токсичности с электрохимической регистрацией.