Постановка иммунологических реакций и учет результатов.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Составитель: преподаватель Гуц Н.И.

Предисловие

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология - это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология - это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке по разделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы.

Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

Введение

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня - на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы.

К тестам I уровня относят:

определение функциональной активности фагоцитов;

определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:

определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;

тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);

- оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки; 

оценка активности киллерных лимфоцитов; 

выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);

- определение различных компонентов комплемента;

- оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;

- тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;

- анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

лимфоцит антиген иммунодиагностика

1. Области использования иммунодиагностики

Представляем данные об использовании иммунологических методов в разных областях медицины. Современная диагностика любого инфекционного заболевания основывается на обнаружении возбудителя болезни (бактериологические методы, ПЦР) или на выявлении специфического иммунного ответа на возбудителя (антитела, ГЗТ). Так, в диагностике ВИЧ-инфекции выявление антител с помощью ИФА является скрининговым методом, а подтверждающим - иммуноблотинг, позволяющий идентифицировать антитела к различным антигенам вируса. Все вирусные, многие бактериальные инфекции диагностируют путем выявления специфических антител (IgM и IgG) к поверхностным антигенам микроорганизмов. ГЗТ чаще оценивают in vivо, например, в диагностике туберкулеза.

Эндокринология, гематология и другие области внутренней медицины широко используют иммунологические методы в диагностике.

Верификация опухолевого клона в диагностике онкологических и онкогематологических заболеваний проводится морфологическими методами («золотой» стандарт) и путем фенотипирования опухолевых клеток. Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки. В диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ) могут использоваться иммунологические методы, в частности, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. Минимальной резидуальной или минимальной остаточной болезнью называют небольшую популяцию опухолевых клеток, которая не может быть зафиксирована с помощью морфологических методов, но обнаруживается более тонкими методами исследования, выявляющими 0,03%- 0,5% клеток аберрантного фенотипа.

Определение концентрации различных биологически-активных веществ: гормонов, онкофетальных антигенов, витаминов и других молекул, не определяемых стандартными биохимическими методами, может осуществляться только на основе иммунологических методов (главным образом, ИФА).

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

Для объективной оценки состояния иммунной системы человека введено понятие об иммунном статусе. Иммунный статус - это комплекс показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов, гуморальный и клеточный иммунитет, фагоцитарное звено, то есть практически всю иммунную систему человека в данный момент времени. Исследование иммунного статуса проводится с целью уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции и других вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.

Иммунодиагностика предполагает идентификацию нарушенного звена иммунной системы, индивидуальна для данного заболевания у конкретного больного. Наибольшее значение иммунодиагностика имеет при иммунодефицитах. При аутоиммунных заболеваниях иммунологические методы применяются для подтверждения клинического диагноза: например определение аутоантител. При аллергических заболеваниях иммунодиагностика позволяет выявить причинный аллерген и определяет возможности аллерген-специфической иммунотерапии. Дальнейшее изучение дисциплины, а именно частных вопросов иммунопатологии, предполагает анализ результатов исследования иммунного статуса для постановки диагноза и показаний к терапии.

Для оценки иммунной системы человека рекомендованы следующие основные методы (ВОЗ, 1993):

.   Т-лимфоциты

определение субпопуляций

оценка пролиферации in vitro на митогены

оценка цитотоксичности

оценка эффекторов ГЗТ

кожные тесты с микробными АГ in vivo

.   В-лимфоциты

определение количества В-клеток

иммуноглобулины, субклассы

иммунные комплексы

оценка пролиферации in vitro

оценка продукции АТ разной специфичности

.   Моноциты/макрофаги

фагоцитоз

хемотаксис

адгезия

4. Неспецифические факторы защиты

компоненты системы комплемента

белки острой фазы

.   Цитокины

определение концентрации цитокинов в сыворотке

определение растворимых рецепторов цитокинов

определение внутриклеточных цитокинов.

Далее приведены основные иммунологические методы, используемые для оценки иммунной системы человека.

Основными объектами для иммунологического обследования являются иммунокомпетентные клетки (Т-, В, NK-лимфоциты, моноциты),получаемые из периферической крови, а также регуляторные и эффекторные молекулы (цитокины, комплемент и др.) из сыворотки (плазмы) крови. В некоторых случаях исследуются иммунокомпетентные клетки и регуляторные молекулы из тканей и различных биологических жидкостей.

Таблица.Действие традиционных лекарственных средств на показатели лейкограммы

Динамика Т-клеток при различных заболеваниях (по Б.Н. Райскис и соавт.)

Динамика Т-лимфоцитов хелперов/индукторов при различных заболеваниях (Б.Н. Райскис и соавт.)

Динамика В-клеток при различных заболеваниях

.Динамика IgG при различных заболеваниях (Б.Н. Райскис и соавт.)

Динамика IgA при различных заболеваниях (Б.Н. Райскис и соавт.)

Динамика IgM при различных заболеваниях (Б.Н. Райскис и соавт.)

Рис. Алгоритм оценки клеточного звена иммунитета при иммунодефицитах

Рис. Алгоритм оценки системы комплемента при иммунодефицитах

Иммунологические часы (компас). При анализе иммунограмм необходимо помнить, что во многих случаях наиболее важным является Т-звено иммунитета. Информативны регуляторные субпопуляции Т-клеток (CD4⁺-лимфоциты и CD8⁺-клетки). Авторами разработана шкала оценки вариантов иммунных расстройств, позволяющая иногда диагностировать некоторые заболевания до их клинического проявления. Возможны следующие варианты.

1. Умеренное увеличение содержания CD4⁺-лимфоцитов и умеренное снижение CD8⁺-клеток характерно для аутоиммунных и аллергических заболеваний.

Таблица 12.Трактовка динамики цитокинов

2. Умеренное увеличение CD8⁺-клеток и умеренное снижение CD4+- лимфоцитов свидетельствует об иммунодефицитных заболеваниях.

3. Накопление CD8⁺-клеток и почти полное отсутствие CD4⁺-лимфоцитов встречается при злокачественных новообразованиях.

4. Снижение количества CD4⁺-лимфоцитов и нормальное содержание CD8⁺-клеток регистрируется при СПИДе, СПИД-подобных комплексах и ассоциированных с ними заболеваний различной этиологии.

5. Повышение CD4⁺-лимфоцитов и нормальное содержание CD8+- клеток наблюдается при аутоиммунных процессах и заболеваниях.

6. Нормальное содержание CD4⁺-лимфоцитов и увеличение CD8+- клеток сопровождает иммунодефицитные состояния, реже опухоли и аутоаллергические заболевания.

7. Нормальное количество CD4⁺-лимфоцитов и снижение CD8+- клеток присуще аллергическим и аутоиммунным процессам и заболеваниям.

8. Снижение числа CD4⁺-лимфоцитов и CD8⁺-клеток случается при интоксикациях, после проведения массивной иммуносупрессорной терапии, ионизирующего облучения, стрессов.

9. Увеличение количества CD4⁺-лимфоцитов и CD8⁺-клеток маркирует начало вирусных инфекций, иногда задолго до развертывания клинической картины.

Определение степени иммунных расстройств. Не каждое формирование иммунных расстройств служит основанием для назначения иммунокорректоров. Предлагается следующая универсальная формула для ее определения (показатель больного/нормальный показатель-1)100%.Если рассчитанная величина имеет знак «минус», у больного определяется иммунная недостаточность, если «плюс» - гиперфункция иммунной системы. Когда полученная величина лежит в интервале 1-33%, это оценивается как первая степень иммунных расстройств, что является транзиторным состоянием и не требует коррекции, диапазон колебаний 34-66% соответствует второй степени, превышение 66% - третьей. В последних двух случаях применение модуляторов обязательно.

Формула расстройств иммунной системы(ФРИС). Суть метода заключается в том, что отбираются показатели, имеющие значимую 2-3 степень иммунных расстройств, группируются по звеньям с указанием вектора вариации параметра (стимуляция, супрессия) и степени динамики. Например, у больных с ХОБЛ ФРИС имеет вид CD3^-₃CD19^-₂IgA^-₂ - снижение количества Т-клеток предельной выраженности и супрессия уровня В-лимфоцитов и IgA второй степени.