Признаки размножения вирусов в куринном эмбрионе.

Обнаружить вирус в курином эмбрионе можно по следующим признакам.

Во-первых, это гибель куримого эмбриона в характерные для данного вируса сроки.

Во-вторых, иногда, даже если гибели зараженного эмбриона не происходит, при вскрытии его обнаруживаются патологоанатомические изменения., появляющиеся в различных структурах эмбриона. Поражения ХАО в виде отечности, кровоизлияний, узелков (оспин) наблюдают при заражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими. Размер и морфология оспин могут заметно различаться при размножении разных вирусов. Кроме того, патологоанатомические изменения наблюдаются в самом зародыше: он может отставать в росте и развитии от незараженных (феномен карликовости), обезвоживаться и мумифицироваться, у него характерно перекручивается шея. Эти изменения в зараженном эмбрионе проявляет вирус инфекционного бронхита кур. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Изменения могут наблюдаться и во внутренних органах: набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень зародыша является результатом действия вируса гепатита утят. Некоторые вирусы, размножаясь в курином эмбрионе, не вызывают ни их гибели, ни патологических изменений в органах. Такие вирусы, если они обладают способностью агглютинировать эритроциты, можно обнаружить при помощи реакции гемагглютинации (РГА).

10. Методы обнаружения вируса в культуре клеток.(Методичка, стр. 39)

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

Цитопатический эффект, определение, классификация.

(Бабичев, стр. 306, Методичка, стр. 45)

Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Цитопатическое действие вирусов может проявляться в виде следующих изменений:

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки и др.).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита и др.).

3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори и другие).

12. Методы типирования вирусов. (Бабичев, стр. 306)

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) изменение проявления цветной пробы;

4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации;

5) нейтрализация в опытах на животных.

Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлуоресценции, ДНК – ДНК-(РНК – РНК) – гибридизации, а также ПЦР.

13. Сущность реакции гемадсорбции.(Бабичев, стр. 306, Методичка, стр. 46)

Гемадсорбция– это адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Некоторые вирусы, в частности вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей).

При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образую характерные скопления.

14. Сущность метода цветных проб.(Методичка, стр. 46)

Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды.

В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

15. Сущность метода бляшек. (Методичка, стр. 46)

Метод бляшек предложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Сущность реакции гемагглютинации для обнаружения вирусов.

(Методичка, стр. 47)

Реакция гемагглютинации (РГА) — это ме­тод об­на­руже­ния и иден­тифи­кации ви­ру­сов, ос­но­ван­ный на на­ли­чии у не­ко­то­рых ви­ру­сов спо­соб­но­сти из­би­ра­тель­но

агглю­ти­нировать эрит­роци­ты опре­де­лен­ных ви­дов жи­вот­ных.

Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 мин.

Метод применяется для диагностики инфекционных заболеваний, таких как сальмонеллез, брюшной тиф, столбняк, коклюш и др.