Полимеразная цепная реакция

Открытая в середине 80-х годов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов. В ходе каждого цикла реакции из исходной молекулы образуются две копии. Каждая из синтезированных копий ДНК может служить матрицей для синтеза новых копий ДНК в следующем цикле. Таким образом, многократное повторение циклов, приводит к возрастанию количества копий в геометрической прогрессии. Из расчетов следует, что даже при наличии 30 циклов, число копий исходной молекулы составит более 1 миллиарда. Даже если учесть, что в ходе каждого цикла дуплицируются не все ампликоны, то общее количество копий, несмотря на это, составляет достаточно большую цифру.

Каждый цикл полимеразной цепной реакции (ПЦР) состоит из следующих этапов:

- Денатурация - Повышение температуры вызывает раскручивание и расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные;

- Отжиг - Снижение температуры позволяет праймерам присоединиться к комплементарным участкам молекулы ДНК;

- Элонгация - Фермент ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь.

Для амплификации избранного фрагмента используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих определенный участок ДНК. Праймеры ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ДНК-полимераза осуществляет синтез (достройку) взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с праймеров. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Каждая цепь молекулы ДНК, образующаяся с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью другого праймера.

Применение Полимеразной цепной реакции

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах [3].

Криминалистика. ПЦР используют для сравнения так называемых "генетических отпечатков пальцев". Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев.

Установление отцовства. Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. Отец. Ребенок. Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Медицинская диагностика. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина. Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого - отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром может быть более активен, у другого - менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием.

Клонирование генов. Клонирование генов - это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Секвенирование ДНК. В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

Мутагенез. В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Методы ПЦР для анализа ГМО

В настоящее время для определения ГМО используют методы генной диагностики: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), ДНК- микрочиповую технологию и анализ нуклеотидных последовательностей, амплификацию генов с последующей ДНК – гибридизацией, а также иммуноферментный анализ (ИФА).

Методы ПЦР заключаются в выявлении рекомбинантной ДНК при использовании для создания трансгенных растений «кассет экспрессии». В случае применения другой генетической конструкции данный метод неадекватен. Центром «Биоинженерия» разработан ряд методов выделения ДНК практически из всех видов продуктов, что позволяет осуществить надежную идентификацию продукции, полученной из ГМО.

Метод ПЦР, имеющий несколько модификаций, является наиболее распространенным, т.к. модифицированная ДНК синтезируется во всех частях ГМО. ДНК более стабильна, чем белок, и в меньшей степени разрушается при технологической или кулинарной обработке пищевых продуктов, что делает возможным определение в них ГМО.

Метод идентификации рекомбинантной ДНК включает несколько этапов:

• выделение ДНК из пищевого продукта

• умножение (амплификация) специфической ДНК, характерной для определенного сорта генетически модифицированного растения

• электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и фотографирование результатов электрофореза [1].

При создании трансгенного растения в геном вносится генетическая конструкция, которая состоит не только из гена, определяющего новый признак, но и последовательностей ДНК, регулирующих работу гена. Для этих целей используется метод ПЦР с маркерами на последовательность ДНК (ген), определяющий новый признак. Результат анализа позволит обнаружить тот сорт генетически модифицированного растения, который был использован при производстве анализируемого продукта.

Объединенный Научный Центр Европейской Комиссии объявил этот метод в качестве стандартного метода (полимеразная цепная реакция); он используется в таких странах как Германия, Италия, Испания, Ирландия, Португалия, Швейцария, Норвегия, Австрия, Бельгия, Канада, Дания, Финляндия, Япония, Южная Корея, Швеция, Великобритания.

В России в 2000 году метод ПЦР был утвержден Минздравом РФ в качестве основного для идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах. Чувствительность этого способа позволяет определить ГМИ в продукте, даже если его содержание не превышает 0,9%. Такой подход соответствует рекомендациям ВОЗ, принятым в большинстве стран мирового сообщества.

Качественный и количественный анализ ГМО проводят с помощью ПЦР. Обнаружение в исследуемой пробе ПЦР – продуктов размером 196 п.н. и 180 п.н. или одного из них, свидетельствует о наличии ГМО.

При создании количественного метода наиболее технологичной стала ПЦР в реальном времени, которую проводят с меченными флюоресцентной меткой праймерами. Этот метод позволяет определить продукты реакции непосредственно в течение амплификации без последующего электрофореза.

В основе новейшей технологии – ПЦР в реальном времени – лежит принцип одновременной флюорометрической регистрации результатов реакции по мере накопления ее продуктов в масштабе реального времени. Ускорение сроков реакции и повышение ее специфичности делают этот метод лабораторного анализа по-настоящему экспрессным. Проводя мультиплексную диагностику на отдельных приборах, можно одновременно выявлять несколько агентов в одной пробе. Оборудование для ПЦР – диагностики в реальном времени автоматизированное, компактное и просто в эксплуатации, не требует отдельной чистой комнаты [2].