Микроклональное размножение

Конец XIX ― начало XX в.

Х. Фехтинг, К. Рехингер, Г. Габерланд.

1932 г. – Р. Готре, Ф. Уайт – подобрали opt состав питательной среды;

1952 г. – Г. Морель, К. Мартин – получили первые безвирусные растения.

Метод культуры изолированных тканей растений применяют

для получения безвирусных растений,

быстрого размножения сортов, у которых при семенном размножении не получают стабильного по декоративным качествам потомства (хризантема, орхидные, фрезия, ирис, луковичные, гербера, а главное — ремонтантная гвоздика),

для получения растений со спортовыми отклонениями от исходных сортов. Возникновение спортов при этом обусловлено мутагенным действием регуляторов роста, которые могут вызывать полиплоидизацию растущих каллусных клеток.

Для этого используют не только апикальную меристему растений, но и части листьев, цветоносов, цветков (пыльники, цветоложе).

Для выращивания изолированных тканей требуются:

определенный микроклимат в культивационных помещениях,

стерильность всех инструментов и питательных сред,

система контроля за качеством получаемого материала (вирусная стерильность, сохранение сорта).

Выращивание изолированных тканей делят на четыре этапа:

первый — эксплантация (вычленение) исходной ткани растения (на этом этапе необходимо получить свободную от видимой инфекции ткань, добиться ее выживания и быстрого роста);

второй — собственно микро-размножение, при котором нужно обеспечить увеличение количества микро-черенков;

третий — укоренение полученных микро-побегов и сохранение их в прохладном помещении;

четвертый — закаливание растений, повышение их устойчивости к внешней среде.

Технология выращивания растений включает:

- приготовление и стерилизацию питательной среды;

- подготовку и стерилизацию растительного материала и оборудования на этапе вычленения тканей;

- изоляцию и посадку кусочков тканей на питательную среду;

- выращивание ткани в термостатированных условиях (получение растений-регенератов, или vitro-растений);

- пересадку растеньиц в оранжерейные субстраты и выращивание из них маточных растений в условиях, исключающих возможность вирусного инфицирования;

- проверку растений на наличие вирусных заболеваний и отбор здоровых растений;

- получение здорового посадочного материала от здоровых маточников.

Развитие кусочка ткани на среде может идти по-разному:

непосредственно образуется проросток и растеньице из него;

образуется каллус, который затем пересаживают (пассируют) на другую среду, где он дает начало побегам.

Для получения растений-регенератов важно обеспечить последовательность прохождения фаз органогенеза.

Первая фаза органогенеза — переход недифференцированной растущей ткани к образованию регенерационной меристемы и закладке стеблевых точек роста. Эта фаза обеспечивается преобладанием в среде цитокининов над соединениями с ауксиновой активностью.

Вторая фаза органогенеза — переход возникших образований к активному формированию побегов и корней. Для этой фазы необходима среда с относительно низким минеральных солей и содержанием веществ с ауксиновой активностью.

Режим:

Температуру воздухаподдерживают в пределах ±2°С от оптимальной для конкретного вида. Декоративные растения по отношению к температуре в период выращивания их методом культуры тканей делят на три группы.

Оптимальные пределы температур для этих групп равны :

20-22 °С,

25-27°С и

28-29 °С.

Поэтому температуру регулируют в пределах от 20 до 29 °С.

Оптимальная относительная влажность воздуха 70%.

Более высокая относительная влажность воздуха может привести к увлажнению ватных пробок и инфицированию культур в пробирках, а более низкая — к высыханию среды, содержащей агар, или к изменению концентрации солей в жидкой среде.

Воздух в термостатной должен быть чистым, без посторонних примесей.

Освещение обеспечивается люминесцентными лампами. Освещенность 1—2 тыс. лк.

Питательная среда

В результате многочисленных исследований с разными видами растений созданы среды:

— агаризованные,

 полутвердые,

 жидкие.

Большинство из них включает в себя

 минеральные макро и микроэлементы,

 углеводы,

 витамины,

 аминокислоты,

 регуляторы роста — ауксины и цитокинины.

Наиболее часто используют среды Ф, Уайта, Г. Мореля,  Т. Мурасиге и Ф. Скуга, X. Линсмейера и Ф. Скуга, Н. Буюса.

Наиболее универсальна и эффективна для большинства декоративных культур среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга.

В состав этой среды входят следующие вещества (в мг/л агаризованной среды)

макросоли: KNО₃ — 1900, NH₄NО₃ — 1650, CaCL*2Н₂О — 440, КН₂Р O₄ — 170, MgSO₄ 7H₂О — 370, Na₂*ЭДТА — 37,3, Fe₂SO₄*7H₂О — 27,8,

микро-элементы: Н₃ВО₃ — 6,2, MnSO₄ — 22,3, ZnSO₄ 7H₂О — 8,6, K — 0,83, Na₂Mo O₄ 2H₂О — 0,25, CuSO₄*5H₂О — 0,025, СоС₁₂*6Н₂О — 0,025, сахароза — 30 000—50 000,

гидролизат казеина — 1000,

мезоинозит —100,

глицин — 2,0,

витамин В6 — 0,5,

витамин B — 0,1,

витамин РР — 0,5.

Оборудование меристемной лаборатории

Шкаф вытяжной химический

Ламинарные боксы

Шкафы сухого хранения

Световые комнаты

Комната для доращивания растений

Климатические камеры

Сушильные шкафы

Инкубаторы и термостаты

Водяные бани

Термоблоки для пробирок