Стадии проведения ПЦР анализа

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего образования

«Дальневосточный федеральный университет»

Кафедра товароведения и экспертизы товаров

Лукерина Лариса Алексеевна

Реферат

по дисциплине «Товароведение однородных групп непродовольственных товаров»

Направление подготовки 38.03.07 «Товароведение»

Профиль «Товароведение и экспертиза товаров в сфере таможенной деятельности»

Очной формы обучения

г. Владивосток

2018

Оглавление

1 Репликация ДНК.. 3

2 Принцип метода ПЦР. 5

3 Этапы ПЦР. 6

4 Стадии проведения ПЦР анализа. 9

5 Виды ПЦР и применение ПЦР. 11

Репликация ДНК

Объектом исследования данного метода является Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК является универсальным носителем генетической инфор­мации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганиз­мы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соеди­ненных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5'-концу одной нити соответствует 3'-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. Данный процесс называется репликацией. Репликация молекулы ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из двух цепей «материнской» молекулы служит матрицей для «дочерней». После репликации вновь синтезированная молекула ДНК содержит одну «материнскую» цепочку, а вторую - «дочернюю», вновь синтезированную (полуконсервативный способ). Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходимо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном.

Начало репликации активируется праймерами (затравками), состоящими из 100-200 пар нуклеотидов. Фермент ДНК-хеликаза раскручивает и разделяет материнскую спираль ДНК на две нити, на которых по принципу комплементарности при участии фермента ДНК-полимеразы собираются «дочерние» цепи ДНК. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии праймера, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. В каждом репликоне ДНК-полимераза может двигаться вдоль «материнской» нити только в одном направлении (5`=>3`).

На лидирующей нити по мере раскручивания репликона постепенно непрерывно наращивается «дочерняя» цепь. На отстающей нити дочерняя цепь синтезирует также в направлении (5`=>3`), но отдельными фрагментами по мере раскручивания репликона.

Таким образом, присоединение комплементарных нуклеотидов «дочерних» нитей идет в противоположных направлениях (антипараллельно). Репликация во всех репликонах идет одновременно. Фрагменты и части «дочерних» нитей, синтезированные в разных репликонах, сшиваются в единую нить ферментом лигазой. Репликация характеризуется полуконсервативностью, антипараллельностью и прерывистостью. Весь генном клетки реплицируется один раз за период времени, соответствующий одному митотическому циклу. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная (рис. 1).

Рис. 1. Схема репликации молекулы ДНК.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1. расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2. присоединение праймеров;

3. достраивание цепи дочерней нити.

Принцип метода ПЦР

Именно репликация ДНК легла в основе ПЦР. В ПЦР перечисленные выше процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании рас­твора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоедине­нию или "отжигу" праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72°С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Другими словами метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК - полимеразой.

Наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, поэтому для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Этапы ПЦР

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах (рис. 2).

· 1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-95° в течение 30-40 сек.

· 2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответст­вующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического уча­стка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой распола­гаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 сек.

· 3 этап: достраивание цепей ДНК. Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения прай­меров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК–ампликона (рис. 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2", где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента ме­тодом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

· ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

· Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм)

· Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК, 2-3 мМ).

· Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента, PH 6,8-7,8).

Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначало получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Рис. 2. Амплификация (1-ый цикл)

Рис. 3. Амплификация (2-ой цикл)

Основные области применения ПЦР

· клиническая медицина:

· диагностика инфекций,

· выявление мутаций, в том числе диагностика наследственных заболеваний,

· генотипирование, в том числе HLA-генотипирование,

· клеточные технологии

· экология (как способ мониторинга состояния и качества объектов окружающей среды и продуктов питания)

· определение трансгенных организмов (ГМО)

· идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

· общая и частная биология,

· фармакология,

· ветеринария.

Стадии проведения ПЦР анализа

Территориально разделяют, размещая их в отдельных помещениях (рис.4,5):

· Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с исследуемыми агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

· Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение проводится в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

Врачи-лаборанты работают в специальной лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках. Обработка одежды из разных помещений произво­дится отдельно. На разных этапах проведения ПЦР-анализа работают различные сотрудники.

Для работы используют отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Все этапы работы проводят только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т. д. Обязательно меняют наконечни­ки при переходе от пробы к пробе. Необходимо использовать наконечники с фильтром - аэрозоль­ным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры или емкости, содержа­щие дезинфицирующий раствор. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места в каждом помещении имеется ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.

В ПЦР-диагностической лаборатории исключается проведение работ, связанных с получени­ем (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

Виды ПЦР и применение ПЦР

Существует немало модификаций основного процесса ПЦР.

Обратная ПЦР используется, когда уже имеется известная последовательность и ставится задача продолжить исследование неизвестных участков ДНК.

Случайно амплифицированные полиморфные ДНК (RAPDs) - метод исследования генетического родства для амплификации произвольно выбранных последовательностей. Задача RAPDs проверить, насколько близки два родственных организма. Например, сравнить образец крови с места преступления и образец крови подозреваемого или, в случае эпидемии, отделить болезнетворные микробы от безвредных. В этом случае неизвестно, в каком гене возникли ПЦР-фрагменты, достаточно, получив их, разделить с помощью гель-электрофореза для сравнения.

Добавление искусственных рестрикционных участков во время ПЦР используется, если ставится задача дальнейшего секвенирования или клонирования последовательности определенного гена , поскольку в таком случае потребуются удобные участки для рестрикционных ферментов.

Обратно-транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР) – метод амплификации кДНК . В этом случае в одной и той же пробирке сначала происходит реакция обратной транскрипции мРНК, а затем – амплификация полученной кДНК , что позволит получить копии эукариотического гена без интронов .

Один из вариантов ПЦР называется "ПЦР с дифференциальным отображением", который используется для специфической амплификации мРНК из эукариотических клеток. Этот метод представляет собой сочетание RAPDs с ОТ-ПЦР и имеет свою особенность - использование праймеров олиго-dT. Поскольку почти все эукариотические молекулы мРНК имеют 3'-хвост из множества оснований А, искусственный праймер, состоящий только из Т-оснований образует пары оснований с этим хвостом.

Так как в ходе полимеразной цепной реакции происходит амплификация определенного участка ДНК, регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении амплификации (по конечной точке), либо непосредственно в ходе реакции (ПЦР «в реальном времени»).

Классическая ПЦР предполагает анализ результатов реакции "по конечной точке", из которых наиболее часто применяемыми являются гель-электрофорез ,гибридизационно-ферментный анализ (ГиФа) и флуоресцентная детекция (FLASH), дающие статистическую картину динамичного процесса. ПЦР "в реальном времени" - метод флуоресцентной регистрации накопления ДНК непосредственно в ходе реакции позволяет к тому же регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК, что чрезвычайно удобно при анализе уровня исследуемых транскриптов, в ДНК-диагностике, при генотипировании. Вместе с тем обычная ПЦР по-прежнему используется в задачах, в которых интеркалирующие красители лучше исключить из состава реакционной смеси.

ПЦР в судебной медицине

Одним из практических применений ДНК-технологии является ее использование для идентификации людей по образцу крови или других тканей. Этот метод используется в криминалистике для определения вины или невиновности обвиняемых или для установления отцовства.

Большинство физических различий между людьми возникает вследствие сложных взаимодействий нескольких генов в процессе развития. Некоторые из них очевидны с первого взгляда, другие являются более тонкими, как, например, отпечатки пальцев, (рисунок которых также зависит более чем от одного гена). Еще одним, более фундаментальным набором идентификационных признаков являются белки, вырабатываемые всеми клетками. В качестве примера различий между белками можно привести различные группы крови, характерные для людей. Белки, содержащиеся в крови, обнаруживаются с помощью антител. Поэтому обычно их называют антигенами крови. Соединение антитела со своим антигеном очень специфично. Соответственно, два родственных белка с относительно небольшими различиями формы можно дифференцировать, поскольку они будут присоединяться к различным антителам.

Самым уникальным является определение генотипа . Существует два основных типа такого анализа - снятие отпечатков ДНК и ПЦР.

ПЦР используется, когда количество ДНК недостаточно или ДНК слишком разрушена для снятия отпечатков ДНК. К тому же снятие отпечатков ДНК требует относительно длинных нитей ДНК. ПЦР наиболее полезна для участков ДНК с высокой индивидуальной изменчивостью: если два образца совпадают в нескольких зонах с высокой изменчивостью, то они, вероятно, принадлежат одному и тому же человеку. Основное отличие между методами заключается в том, что снятие отпечатков ДНК основано на уникальности рисунка полос, образуемого рядом фрагментов ДНК после их разделения по длине с помощью гель-электрофореза , т.к. рестрикционные ферменты нарезают фрагменты разной длины у разных людей, а анализ ПЦР призван определить присутствие или отсутствие определенных последовательностей.

Диагностика инфекционных заболеваний

ДНК-диагностика – новая область медицины, использующая молекулярно-генетические методы для ранней диагностики заболеваний, выявления предрасположенности к ним и профилактических рекомендаций.

Развитие таких технологий амплификации ДНК как ПЦР, произвело буквально революцию в клинической вирусологии, позволив быстро, точно и достаточно просто определить наличие вирусов в образце, поскольку известны последовательности ДНК многих болезнетворных микроорганизмов. Можно создать два праймера ПЦР, соответствующих последовательности исследуемого патогена (например, вируса) и расположенных на известном расстоянии на ДНК. Если затем выполнить ПЦР с использованием этих праймеров и с помощью гель-электрофореза провести анализ полученных продуктов, то в случае принадлежности исследуемого образца тому же вирусу, мы получим фрагмент, длина которого соответствует взятой для сравнения последовательности ДНК. Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале появляется характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК.

Выявляя единичные клетки бактерий или вирусов, ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

В клинической практике метод ПЦР часто используется для выявления вирусных гепатитов, опасных для человека, таких как: А , В , С, "Проведение типирования вируса гепатита С" , Дельта , Е, G , TTV.

Важную роль метод играет в диагностике заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП). Этиологическим фактором являются вирусы, бактерии и простейшие.

К таким заболеваниям можно отнести появление доброкачественных аногенитальныхбородовок (кондилом) , вызываемых вирусом папилломы человека (ВПЧ). Такие бородавки обычно появляются на участках, травмированных во время полового контакта. Генотипы ВПЧ 6 и 11 обнаруживаются более чем в 90% случаев. Такие пациенты могут быть одновременно инфицированы и ВПЧ типа 16 и 18, которые являются источником субклинических поражений, сочетающихся с внутриэпителиальной неоплазией и аногенитальным раком. Имеются доказательства, что папилломавирусы, относящиеся к высокоонкогенным (папилломавирусы высокого онкогенного риска - 16,18, 31,33,35, 39,45, 51, 56, 58, 59, 68), являются этиологическим фактором возникновения рака шейки матки.

К заболеваниям передающихся половым путем относятся также и гепатиты В и С. Высокой степени риска инфицирования подвержены гомосексуалисты, лица занятые в сфере оказания сексуальных услуг.

К наиболее распространенным инфекция, передающихся половым путем и диагностируемых методом ПЦР, являются урогенитальные инфекции, вызываемые патогенным микроорганизмом как у мужчин, так и у женщин - Chlamydiatrachomatis (хламидия трахоматис). Их диагностика особенно важна для установления диагноза и лечения у лиц с бессимптомным течением. Выявление хламидий трахоматис важно также для установления этиологического фактора, вызвавшего у мужчин орхоэпидидимит (в таких случаях одновременно следует проводить и диагностику методом ПЦР на выявлении гонореи –Neisseriagonorrhoeae). Обнаружение хламидий является важным моментом для диагностики воспалительных заболеваний малого таза у женщин: сальпингита (воспаление маточных труб), эндометрита, параметрита, оофорита (воспаление яичников), тазового перитонита. Другим распространенным инфекционным агентом является бактерия, относящаяся к виду микоплазм - уреаплазма, как правило, передающаяся половым путем (Ureaplasmaurealyticum) и ее клинически значимые биоварыParvum/T960, вызывающие воспалительные заболевания органов мочевыделительного тракта и их осложнения: простатит, бактериальный вагиноз, бесплодие.

Применения метода ПЦР оправдано для выявления этиологического фактора уретрита. При гонококковом уретрите методом ПЦР выявляют Neisseriagonorrhoeae. Причиной негонококковых уретритов чаще бывают - Chlamydiatrachomatis (в 30-50% случаев), Ureaplasmaurealyticum и Mycoplasmagenetalium (возможно 10-20% случаев). К другим факторам негонококковых уретритов можно отнести Trichomonasvaginalis(до 17% случаев) - жгутиковое постейшее, передающееся у взрослых практически только половым путем , а также грибки рода Candidaalbicans (кандида), вызывающие вульвовагинальный кандидоз.

Хотя бактериальныйвагиноз (при синдроме влагалищных выделений) не относится к заболеваниям передающимся половым путем, методом ПЦР диагностики при этом заболевании можно выявить таких микроорганизмов как, Gardnerellavaginalis, Mycoplasmahominis, Mobiluncus, избыточная концентрация которых приводит к замещению молочнокислых бактерий влагалища и увеличению рН среды.

К числу распространенных заболеваний, передаваемых половым путем, относятся заболевания вызываемые вирусом герпеса 2 типа (ВПГ-2 - генитальный герпес), который в классических случаях проявляется появлением типичных папулезных высыпаний, переходящих в пузырьки и изъявления, а также местным лимфаденитом. Следует учитывать, что и вирус простого герпеса 1 (ВПГ- 1) также выявляется при поражении гениталий. Герпес ВПГ 1 является причиной, так называемого орально-лабиального герпеса, и вызывает герпес слизистых, кожи, герпетические энцефалиты, офтальмогерпес.

Инфицирование любым из этих двух вирусов приводит к развитию сходного первичного заболевания. Но частота рецидивов заболевания выше при инфицировании герпесом второго типа. Клинические признаки заболевания у пациентов существенно различаются. Инфицирование герпесом может протекать, например, в виде дерматозов или других генитальных инфекций. Поэтому лабораторная диагностика, и в частности ПЦР-метод, является важным приемом в установлении этиологического фактора болезни и назначении соответствующего лечения.

К другим герпес-вирусам, тропным для человека и выявляемым при помощи ПЦР, относится вирус герпеса 3 типа – вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай. Вирус герпеса 4 типа – вирус Эпштейн-Барр является причиной инфекционного мононуклеоза, а также ассоциируется с лимфомойБеркита и назофарингеальной карциномой. Вирус герпеса 5 типа – вирус цитомегалии (ЦМВ), является причиной поражения печени, центральной нервной системы, возникновением интерстициальной пневмонии и нефритов, опасен для плода в ранние сроки заражения матери при беременности (выкидыши, мертворождения, рождения с пороками органов и систем). Вирус герпеса 6 и 7 типов (лимфотропные вирусы) относятся к вирусам, ассоциированным с синдромом хронической усталости. Вирус герпеса 8 типа – этиологический фактор саркомы Капоши (часто ассоциируемой с ВИЧ инфекцией).

С появлением ПЦР стало возможным количественное определение вирусной нагрузки (уровня виремии), что особенно важно при острых и персистирующих инфекциях, так как просто детекция вируса не дает всей необходимой информации о течении болезни. К тому же определение вирусной нагрузки позволяет следить за лечением и возникновением резистентности к терапевтическим средствам.

Самое широкое распространение методы ПЦР получили в диагностике таких инфекционных заболеваний, как СПИД (вызываемого ретровирусом ВИЧ), клещевой энцефалит, туберкулез, токсоплазмоз, листериоз, краснуха, вирус, вызывающий инфекционную эритему (парвовирус В19),. гемолитический стрептококк, хеликобактерпилори (Helicobacterpylori – этиологический фактор возникновения язвы желудка). ПЦР диагностике подлежат такие вирусы как: аденовирус, риновирус, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирус, метапневмовирус, вирус парагриппа, вызывающие поражение дыхательных путей и заболевания протекающие у детей часто в виде энтеритов (клиника дизентерии – боли в животе, поносы). При поражении дыхательных путей (пневмонии) метод ПЦР часто используется для идентификации этиологически значимых микроорганизмов в мазках из зева: Chlamydiapneumonia , Mycoplasmapneumonia , Streptococcuspneumonia(при подозрении на стрептококковую пневмонию). У детей использование ПЦР метода, наряду с бактериологическими и серологическими методами диагностики, позволяет установить или опровергнуть диагноз коклюша и обнаружить токсигенные штаммы дифтерии ( Corynebacteriumdiphtheriae ).

Очень важно, что часто, нет необходимости дожидаться симптомов болезни. Например, видимые симптомы СПИДа проявляются иногда спустя несколько лет после заражения вирусом. Тем не менее, можно провести анализ ДНК в образцах крови, используя праймеры ПЦР, соответствующие последовательностям, которые присутствуют только в геноме ВИЧ. Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. К тому же количественное определение РНК ВИЧ позволяет оценить варианты противовирусной терапии и осуществить индивидуальный подбор противовирусных препаратов.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам. Примером этому является туберкулез. В отличие от многих бактерий, микобактерия, вызывающая это заболевание, растет очень медленно. Ее культивирование для выполнения классических диагностических испытаний может занять примерно месяц, в то время как идентификация микобактериальной ДНК с помощью ПЦР может быть выполнена в течение одного дня.

Метод ПЦР эффективен как в отношении внутриклеточных паразитов, выявленных как в клиническом материале, полученном от больного, так и в образцах воды, почвы и т.д.

Диагностика наследственных болезней и предрасположенности к ним

Ошибки в процессах репликации ДНК - изменение одного основания на другое, выпадение или вставка оснований, переворачивание сегмента ДНК или перемещение его из своего положения в другое - приводят к мутациям .Большинство мутаций не оказывают вовсе или оказывают незначительное воздействие на организм. Тем более, что в высших организмах, имеющих по две копии каждого гена , может быть использована резервная копия, и существуют системы контроля повреждения ДНК и системы ее репарации.

Тем не менее, мутации имеют принципиальное значение для человека. Если мутации происходят в репродуктивных клетках, то генетические изменения передаются потомкам. Такие мутации приводят к специфическим (альтернативным) версиям гена – аллелям. При определенных условиях мутации могут закрепиться в популяции и стать достаточно обычными аллельными вариантами, обеспечивая основу генетического полиморфизма. Некоторые мутации (полиморфизмы генов) могут приводить к наследственным моногенным заболеваниям, таким как муковисцидоз, мышечная дистрофия и т.д. Сегодня известно около 6 тысяч таких болезней. Другие - стать фактором предрасположенности к онкогенным, сердечно-сосудистым, аллергическим и другим заболеваниям. В этом случае для развития болезни необходимы определенные условия – вредные факторы окружающей среды, характер питания и т.д. Это полигенные (мультифакториальные) болезни.

Полимеразная цепная реакция позволяет идентифицировать исследуемый ген и обнаружить в нем имеющиеся мутации . Поскольку известны последовательности ДНК некоторых мутантных генов, можно создать праймер, соответствующий последовательности мутантного участка такого гена. Для эффективного осуществления ПЦР 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплиментарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае скорость удлинения праймера резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов реакция может вообще не пройти, особенно если условия гибридизации подобраны таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплементарности гибридных пар. Именно такой подход лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР.

Однонуклеотидным полиморфизмом (ОНП) называют вариабельные позиции в последовательности ДНК генома, для которых частота встречаемости в популяции наименее распространенного варианта превышает 1%. В геноме человека известно несколько миллионов ОНП. Не все однонуклеотидные замены внутри гена приводят к фенотипическому эффекту – генетическому заболеванию, поскольку замена нуклеотида может не привести к изменениям аминокислотной последовательности белка и его функциональных свойств. Но если идентифицирована точечная мутация , вызывающая заболевание, то могут быть получены синтетические олигонуклеотиды, соответствующие нормальной и мутантной последовательностям. Эти аллель-специфическиеолигонуклеотиды можно использовать в качестве праймеров для аллель-специфической ПЦР.

ОНП – основная причина существования аллелей гена . В среднем на 1000 оснований в геноме человека приходится одна вариабельная позиция, при этом распределение ОНП неравномерно, и частота встречаемости на несколько порядков выше в некодирующих регионах генома. Наиболее часто встречающийся полиморфизм – вариация оснований одного типа: A и G (пурин/пурин) или T и C (пиримидин/пиримидин). Полиморфизм с аллелями пурин/пиримидин встречается значительно реже.

Задача ДНК-диагностики – определить наследственные варианты полиморфизма, являющиеся причиной моногенных или полигенных заболеваний. Поскольку у человека двойной набор всех генов, результат диагностики должен содержать информацию о мутации или ее отсутствии в каждом из парных генов. Возможны три варианта заключения: -/- - нормальный вариант полиморфизма генов , мутация отсутствует; -/+ - мутация в гетерозиготной форме (в одном из парных генов); +/+ мутация в гомозиготной форме (в обоих парных генах). При аутосомно-доминантном наследовании мутация проявляется как в гомозиготном, так и в гетерозиготном виде; при аутосомно-рецессивном наследовании мутация проявляется только в гомозиготной форме.

Заключение, полученное с помощью ДНК-диагностики, дает оценку вероятности возникновения заболеваний, ассоциированных с теми или иными мутациями/полиморфизмами и профилактические и лечебно-диагностические рекомендации для пациента и лечащего врача. Проведенные исследования показали, что у 5,3% людей в возрасте до 25 лет разовьются болезни, обусловленные наследственными факторами, а в течение жизни у 60% людей разовьются болезни, связанные с наследственной предрасположенностью. Ограничение современных возможностей лечения наследственных заболеваний и непредсказуемый характер передачи генов от поколения к поколению заставляют сосредоточить внимание на профилактике, как на наиболее надежном и эффективном способе предотвращения этих болезней. Знание степени вероятности возникновения полигенных болезней позволяет снизить величину риска развития заболевания в результате лечения до развития необратимых поражений, поскольку наличие тех или иных полиморфизмов не приводит с неизбежностью к болезни.

Профилактические методы включают также пренатальную диагностику ворсин хориона, которые являются прекрасным источником ДНК плода, что дает возможность родителям, гетерозиготным носителям мутантных генов , иметь только здоровых детей.

Муковисцидоз.

Муковисцидоз – наследственное заболевание желез внутренней секреции, поджелудочной железы и печени, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. Муковисцидоз является одним из наиболее частых моногенных заболеваний, причиной которого являются мутации гена CFTR, кодирующего белок-регулятор мембранной проводимости. В норме этот белок встраивается в мембрану эпителиальных клеток, где фукционирует как хлорный канал (транспорт хлора). Кроме того он регулирует проводимость других каналов.

Известно более 400 мутаций гена CFTR, основными из которых являются del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbc->T, обуславливая 75% генетических дефектов. Самая частая из них – делеция трех оснований F508, вследствие которой белок-регулятор разрушается в цитоплазме, не достигая клеточной мембраны. При других мутациях гена CFTR белок встраивается в мембрану, но не функционирует или функционирует плохо.

Анализ ДНК – единственный способ выявления гетерозиготных носителей мутантного гена . Исследования мутаций гена CFTR важно не только для больных с клиническими проявлениями муковисцидоза. Выявление неблагоприятных мутаций имеет прогностическое значение для практически здоровых людей, снижая вероятность развития заболевания при соответствующих профилактических и лечебных мерах. Тип наследования – аутосомно-рецессивный .

Вероятность возникновения онкологических заболеваний.

Не только некоторые болезни непосредственно вызваны мутациями, но предрасположенность к заболеваниям также зависит от генетической конституции. Повышенная предрасположенность к раку может наследоваться как и любое наследственное заболевание. Предполагают, что от 5% до 10% рака может возникать в значительной степени по причине полиморфизма генов. Так наследование одной дефектной копии гена BRCA1 делает женщин предрасположенными к раку молочной железы и яичников.

Примерами генетических маркеров риска онкологических заболеваний являются делеция гена мю-1 глутатион S-трансферазы (GSTM1); полиморфизм I105V A->G гена пи-глутатион S-трансферазы (GSTP1); полиморфизм A114V C->T гена пи-глутатион S-трансферазы (GSTP1); делеция гена тета-1 глутатион S-трансферазы (GSTT1); полиморфизм R144С С->T (CYP2C9*2) гена цитохромаCYP2C9 (CYP2C9); мутации гена рака молочной железы и яичников 1 (BRCA1); мутация 6174delT гена рака молочной железы 2 (BRCA2); аллельный полиморфизм гена N-ацетил-трансферазы 2 (NAT2).

Ген GSTМ1 кодирует аминокислотную последовательность фермента мю-1 глутатион S-трансферазы. Делециия гена приводит к значительному снижению способности организма избавляться от вредных соединений и повышению риска развития ряда онкозаболеваний и ИБС (ишемической болезни сердца).

Ген GSTP1 кодирует аминокислотную последовательность фермента пи-1 глутатион S-трансферазы, которая содержится в эритроцитах и участвует в метаболизмексенобиотиков . Полиморфизм I105V (A>G) гена GSTP1 определяется заменой аденина (А) на гуанин (G) с соответствующим изменением аминокислоты в пептидной цепи фермента, что приводит к снижению его активности, накоплению в организме токсичных веществ и увеличению риска развития ряда онкозаболеваний. Например, есть данные о повышении риска развития рака легких у лиц с такими мутациями при курении. Поэтому такие исследования целесообразно проводить у злостных курильщиков. Полиморфизм гена увеличивает также предрасположенность к лейкемии и болезни Паркинсона.

Ген GSTТ1 кодирует аминокислотную последовательность фермента тета-1 глутатион S-трансферазы, участвующего в процессе избавления организма от ксенобиотиков , в частности промышленных канцерогенов (хлорметана и других). При делеции гена и отсутствии фермента способность организма к детоксикации вредных соединений значительно снижается, что увеличивает вероятность развития ряда онкозаболеваний и ИБС. Риск развития заболеваний многократно увеличивается при курении и воздействии химических канцерогенов.

Ген NAT-2 кодирует аминокислотную последовательность цитозольного фермента N-ацетил-трансферазы 2 типа, участвующего во второй фазе метаболизма ксенобиотиков , приводящей к их детоксикации. Полиморфизм гена включает в себя более 20 аллелей , характеризующихся различной активностью фермента, однако для популяций обычно характерны 5-6 вариантов, при этом от активности фермента зависит эффективность очистки организма от многих канцерогенов, онкогенов и некоторых лекарственных средств. Аллельные варианты гена связаны с большим или меньшим риском ряда онкозаболеваний, бронхиальной астмы, сахарного диабета, аллергического контактного дерматита.

Опухоли молочной железы

Считается, что около 5% случаев рака молочной железы имеет наследственную природу. Выделены и охарактеризованы гены, которые, как считается, ответственны за возникновение наследственных форм рака молочной железы. Книмотносятсягены :BRCA 1 и BRCA 2 (Breast Cancer Associated), CHEK2, P53, PTEN.Мутации в этих генах существенно повышают риск развития рака молочной железы, а выявление этих мутаций при помощи ПЦР является приемом, помогающим в диагностике этого заболевания.

В гене BRCA1 закодирован белок, который в клетке участвует в процессах репарации при повреждении ДНК и необходим для поддержания стабильности клеточного генома. В нормальном состоянии этот белок выступает в качестве супрессора опухоли. Однако мутации в этом гене (BRCA1(5382insC)) могут привести к появлению злокачественных клеток. Считается, что такие мутации могут повышать риск развития рака более, чем в 100 раз.

В гене CHEK2, расположенном на плече 22 хромосомы, закодирован фермент – протеинкиназа (серин-треониновыепротеинкиназы), необходимая для обеспечения реакций репарации при повреждении ДНК, а также в апоптозе клеток. Этот ген активируется в ответ на повреждения молекулы ДНК. Можно говорить о том, что данный ген является супрессором опухолевой трансформации клеток. Мутация CHEK2 1100delC приводят к синтезу дефектного фермента, не выполняющего свои функции. Такие нарушения могут приводить к возникновению наследуемых и приобретенных (спорадических) опухолей молочной железы.

Вероятность возникновения сердечно-сосудистых болезней.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) – это или полигенная болезнь, или результат генетической гетерогенности. Раннее развитие ИБС иногда обусловлено мутациями в единичном локусе гена, но чаще ИБС развивается вследствие совместного действия ненаследуемых (курение, нарушение режима питания) со множеством наследственных факторов, влияющих, в частности, на апопротеин(а) , апопротеины(В) , рецепторы липопротеидов, ангиотензин-превращающий фермент (АПФ), сывороточную концентрацию гомоцистеина , на свертываемость крови, молекулы адгезии. Встречаются семейные случаи внезапной сердечной смерти, объяснимые наследственной предрасположенностью к ИБС.

Примерами генетических маркеров риска сердечно-сосудистых заболеваний являются: полиморфизм AluIns/Del I->D гена ангиотензин-превращающего фермента (ACE); полиморфизм М235Т T->C гена ангиотензиногена (AGT); полиморфизм С807Т C->T гена интегрина альфа-2 (GP1a); полиморфизм 27 b.p. perintron 4 (4b/4a) гена cинтазы окиси азота (NOS3); аллельный полиморфизм гена aполипопротеина Е (ApoE); полиморфизм HPA-2 (A1/A2) гена тромбоцитарного гликопротеина 1b (GP1b); полиморфизм VNTR гена тромбоцитарного гликопротеина 1b (GP1b).

В гене ACE закодирована аминокислотная последовательность ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), являющегося регулятором артериального давления и водно-солевого обмена. Существует два варианта полиморфизма этого гена - AluIns/Del I->D, отличающихся вставкой (insertion, I) или делецией (deletion, D) Alu-последовательности в некодирующей последовательности гена ACE. Вариант D характеризуется более высокой экспрессией АСЕ-гена, что приводит к увеличению содержания АПФ и повышенной вероятности артериальной гипертензии и других сердечно-сосудистых заболеваний. Тип наследования - аутосомно-доминантный . При этом риск сердечно-сосудистых заболеваний для гетерозиготной (I/D) формы примерно вдвое ниже, нежели для гомозиготной (D/D) формы.

В гене AGT закодирована аминокислотная последовательность ангиотензиногена, являющегося предшественником ангиотензина II – регулятора артериального давления и водно-солевого обмена. Полиморфизм М235Т T->C гена AGT связан с заменой тимина (T) на цитозин (C), в результате чего в позиции 235 пептидной цепи ангиотензиногена метионин замещается треонином, что увеличивает риск артериальной гипертензии и инфаркта миокарда, особенно у женщин на фоне заместительной гормонотерапии. Генотип С/С обуславливает наибольшую предрасположены к этим заболеваниям.

В гене GP1a закодирована аминокислотная последовательность альфа-2-субъединицы интегринов , являющихся рецепторами тромбоцитов. При помощи этих рецепторов тромбоциты образуют защитный монослой в области повреждения, что приводит к активации каскада системы свертывания крови и прекращению кровотечения. Полиморфизм С807Т C->T гена GP1a вызван заменой цитозина (С) на тимин (Т) с последующим изменением аминокислотной последовательности в пептидной цепи альфа-2-субъединицы интегринов , что приводит к изменению свойств рецепторов и увеличению адгезии тромбоцитов, вызывая повышенный риск тромбофилии. Этот вариант полиморфизма гена может быть маркером повышенного риска инфаркта миокарда и других сердечно-сосудистых заболеваний.

Экспрессия гена cинтазы окиси азота (NOS3) приводит к образованию оксида азота (NO), медиатора, вовлеченного во множество таких процессов организма, как: расслабление гладкой мускулатуры стенки сосудов, регуляция роста сосудов, передача нервных импульсов, снижение аггрегации тромбоцитов, регуляция тонуса гладких мышц, иммунные реакции и многих других. Полиморфизм 27 b.p. perintron 4 (4b/4a) гена NOS3 обусловлен наличием 4-х или 5-ти тандемных повторов из 27 нуклеотидных пар в интроне 4 ("4в" - нормальный вариант из 5 повторов; "4а" - мутантный вариант из 4 повторов). Мутантный вариант приводит к нарушению экспрессии гена и уменьшению образования NO. Проведенные исследования связывают эту мутацию с атеросклерозом, ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда; при диабете 2 типа – с фактором риска гипертонии.

Ген ApoE кодирует аминокислотную последовательность aполипопротеина Е, одного из компонентов метаболизма липидов. Аллельный полиморфизм гена ApoE выражается в замене по двум аминокислотным остаткам, что обуславливает изменение свойств aполипопротеина Е. Чаще всего встречаются три аллельных варианта гена ApoE: *2, *3, *4. Наиболее распространенным является аллель *3. Гетерозиготных носителей варианта *2 характеризует низкий уровень холестерина и бета-липопротеинов в сыворотке крови, частота его выше у долгожителей, но у гомозиготных носителей варианта *2 возможна гиперлипопротеинемия III типа, чувствительная к диетотерапии. Аллель *4 вызывает увеличение общего холестерина и бета-липополипротеинов и снижение антиоксидантной клеточной активности, что является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и болезни Альцгеймера; гомозоготы по этому аллелю реже обычного встречаются у долгожителей.

Ген GP1b кодирует аминокислотную последовательность 1beta-субъединицы рецепторов тромбоцитов, осуществляющих взаимодействие тромбоцитов со стенкой поврежденного сосуда или поврежденной поверхностью атеросклеротической бляшки с помощью адгезивных белков субэндотелия (коллагена, фибронектина, ламинина, фактора Виллебранда). Способность фибронектина и фактора Виллебранда связываться одновременно с рецепторами нескольких тромбоцитов на поврежденной поверхности приводит к закупорке места повреждения и последующему каскаду свертывания крови. Принято рассматривать агрегацию тромбоцитов в области расположения атеросклеротической бляшки центральным процессом в закупорки сосудов. Полиморфизм гена GP1b, меняя способность тромбоцитов к агрегации, может влиять на риск инфаркта или ишемического инсульта. Так HPA-2-полиморфизм, обуславливающий замену аминокислоты треонина на метионин, определяет антигенную принадлежность тромбоцитов (варианты А1 и А2, соответственно). Показано, что носители аллеля А2 имеют повышенный риск коронарного тромбоза, ишемического инсульта и снижение возраста его наступления.

Вероятность нарушений в свертывающей системе крови.

Примерами генетических маркеров риска нарушений свертывающей системы крови являются полиморфизм -148 C->T и полиморфизм -455 G->А гена бета-цепи фибриногена (FGB); полиморфизм L33P С->Т гена тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGB3); полиморфизм 1691 G->A (R506Q) гена F5 («мутация Лейден»); полиморфизм 20210 G->A гена протромбина F2.

Ген FGB кодирует аминокислотную последовательность бета-цепи фибриногена (фактор свертывания крови № 1). Исследование полиморфизма этого гена позволяет оценить относительный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний вследствие нарушений в свертывающей системе крови. Полиморфизм -148 C->T гена FGB представляет собой замену в нуклеотиде цитозина (С) на тимин (Т). Полиморфизм -455 G->А гена FGB связан с заменой в нуклеотиде гуанина (G) на аденин (А). Оба полиморфизма вызывают повышенную экспрессию гена и приводят к увеличению содержания фибриногена в крови и дополнительной вероятности образования тромбов. Вследствие этого повышается риск возникновения ИБС, в том числе ишемического инсульта и инфаркта миокарда.

Ген ITGB3 кодирует аминокислотную последовательность тромбоцитарного рецептора фибриногена, обеспечивающего взаимодействие тромбоцитов с фибриногеном плазмы крови и, следовательно, агрегацию тромбоцитов и образование тромба. Полиморфизм L33P С->Т связан с заменой цитозина (С) на тимин (Т), что приводит к замене аминокислотной последовательности, изменению свойств рецептора и повышенной склонности к агрегации тромбоцитов. Дополнительная степень тромбообразования увеличивает риск инфаркта миокарда, развития острого коронарного синдрома, но хорошо поддается коррекции аспирином.

Ген F5 кодирует аминокислотную последовательность фактора V (фактор свертывания крови №5), являющегося компонентом свертывающей системы крови и активизирующего реакцию образования тромбина из протромбина. Полиморфизм 1691 G->A (R506Q) гена F5 обусловлен заменой гуанина (G) на аденин (A) в положении 1691, что приводит к замене аргинина на глутамин. Замена аминокислоты придает устойчивость активной форме фактора V к расщепляющему действию регулирующего фермента и вызывает усиление свертываемости крови, способствуя развитию сосудистых тромбозов и, соответственно, венозных и артериальных тромбоэмболий, увеличивая тем самым вероятность инфаркта миокарда и инсульта, ряда осложнений беременности.

Ген F2 кодирует аминокислотную последовательность протромбина (фактор свертывания крови №2), являющегося компонентом свертывающей системы крови и предшественником тромбина. Полиморфизм 20210 G->A, обусловленный заменой гуанина (G) на аденин (A) в позиции 20210, приводит к повышенной экспрессии гена и вероятности возникновения инфаркта миокарда и различных тромбозов, в том числе тромбоэмболии легочной артерии. А также к повышенному риску летального исхода при лечении рака, в послеоперационном периоде и в случае тромбоэмболии легочной артерии. Тип наследования аутосомно-доминантный .

Генетические маркеры риска остеопороза.

Остеопороз – патологическое состояние – уменьшение доли костной ткани обычно с замещением ее потери жировой тканью.

Примерами генетических маркеров риска развития остеопороза являются: полиморфизм P447L Т->С гена рецептора кальцитонина (CALCR); полиморфизм 2046 G->T гена коллагена (COL1A1); полиморфизм -13910 С/Т гена лактазы (LPH). Исследование полиморфизма -13910 С/Т гена лактазы (LPH), позволяя выявить непереносимость лактозы, оценивает риск развития остеопороза.