Суть метода щелочного лизиса.

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА БИОХИМИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность: ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЛО

Курсовая работа

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ESCHERICHIA COLI

Студент 4 курса

Группа 01-413

«___»______________2018 г. _____________________ (Эргашев М.Б.)

Преподаватель

Сотрудник кафедры биохимии и биотехнологии КФУ

«___»______________2018 г.______________________(Изотова Е.Д.)

Казань – 2018

Оглавление

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 6

1.1 SaHPF – фактор инактивации рибосомы.. 6

1.2 Методы дезинтеграции клеток : ультразвуковое разрушение. 8

1.3 Анализ: метод определения конкретного искомого белка. 10

1.4. Выделение белка из клетки. 12

1.5. Очищение белков в соответствии с растворимостью, размером, зарядом и связыванием. 12

1.6. Выделение и визуализация белков гель-электрофорезом . 16

1.7. Количественная оценка очистки белка. 20

1.8. Ультрацентрифугирование для разделения биомолекул и определения их масс 22

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 26

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. 26

2.1 Оборудование и реагенты.. 26

2.2 Использованные микроорганизмы и плазмиды.. 28

2.3 Использованные в работе буферы.. 28

2.4 Использованные в работе методы.. 29

2.4.1 Разрушение клеток. 29

2.4.2 Осаждение клеточных фракций. 29

2.4.3 Хроматографическая очистка белка. 30

2.4.4 Определение степени чистоты и однородности раствора белка. 30

3. Результаты исследований и обсуждения. 32

3.1Последовательность эксперимента по экспрессии белка. 32

3.2 Выделение белка N-концевого домена SaHPF из клеток E. coliBL21Star(DE3)/pGS21A- n-domain -SaHPF. 33

3.3 Очистка белка N-концевого домена SaHPF связанного с гистидиновым тагом на заполняемой колонке со смолой Ni-NTA Superflow (QIAGEN) 33

Введение. 4

Выводы.. 37

Списокиспользованнойлитературы.. 38

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Escherichiacoli (или просто E.coli) - это грамотрицательные палочковидные бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia (эшерихия). Названы в честь открывшего их в 1885 году немецкого ученого Т.Эшериха (T. Escherich).
E.coli является обычным обитателем кишечника многих млекопитающихся, в частности, приматов, к числу которых принадлежит и человек. Поэтому ее часто называют кишечной палочкой. В организме человека E.coli выполняет полезную роль, подавляя рост вредных бактерий и синтезируя некоторые витамины.
Кишечная палочка (Escherichiacoli) - один из представителей нормальной кишечной флоры, сапрофит толстого кишечника. Условно-патогенные и патогенные серотипы кишечной палочки вызывают различные формы инфекционного процесса. При инфекциях мочевыводящих путей чаще встречаются серотипы 02, 06, 09, при воспалении желчного пузыря - 01, 08, 011.
У взрослых коли-инфекция чаще всего проявляется воспалительными изменениями в органах, расположенных вблизи кишечника - в мочеиспускательном канале, мочевом пузыре, влагалище, матке (уретрит, цистит, пиелит, пиелонефрит, эндометрит) или сообщающихся с кишечником - желчном пузыре, желчных путях (холецистит, холангит). У детей коли-инфекция может локализоваться в лёгких. Возможны генерализация инфекции и развитие сепсиса.

Плазмида – нехромосомный и в свою очередь самовоспроизводящийся генетический элемент, то есть является фактором наследственности бактерий и некоторых других организмов. Способны к автономному поддержанию в цитоплазме бактерий или существованию в интегрированном в хромосому состоянии, откуда они могут свободно выходить в цитоплазму (иногда с фрагментами хромосомы). Некоторые хромосомы могут распространяться в бактериальной популяции между ее членами.

Плазмидные ДНК определяют ряд важных свойств бактерий:

1. Являются факторами фертильности – определяют донорский фенотип клетки;

2. Контролируют резистентность к антибиотикам, сульфаниламидам, катионам тяжелых металлов, бактериоцинам, бактериофагам, к сыворотке крови;

3. Образует чувствительность к бактериоцинам;

4. Синтез тиамина, пролина, внеклеточной ДНКазы и др.;

5. Синтез антибиотиков и бактериоцинов;

6. Метаболизм углеводов, углеводсодержащих соединений, галогеновых соединений, белков;

7. Фиксацию азота;

8. Продукцию токсинов, гемолизина, антигенов колонизации, капсулы.

История исследования плазмид

Первым плазмиды исследовали в 1921 году Bourdet и Ciuca, которые открыли лизогенные бактерии, способные спонтанно лизироваться. А в 1925 году Gratia обнаружил фактор, подавляющий рост некоторых видов энтеробактерий, которую позже назвали “принцип V”. Wollman в 1928 г. высказал предположение о трансмиссивности факторов лизогенности. В 1932 г. Gratia идентифицировал обнаруженный им фактор, обладавший антагонистической активностью как белковоподобное вещество. Это исследование дало начало изучению колициногенности – способности бактерий E. Coli продуцировать колицины – вещества, подавляющие рост близкородственных бактерий.

Основываясь на сходстве выражения бактериоциногенности и лизогенности бактерий, Fredericq (1946) высказал гипотезу об идентичности продуктов летального синтеза, определяющих названные свойства. Согласно его концепции, детерминанты синтеза колицинов представляют собой дефектный бактериофаг, сохранивший способность летального синтеза, но утративший гены, ответственные за формирование фаговых частиц.

А в 1946 г. Д. Ледерберг и Э. Татум в своих трудах открыли конъюгацию бактерий. Которое в дальнейшем было доказано, что при конъюгации часть клеток являются донорами, а часть реципиентами, что зависит от присутствия внехромосомного фактора фертильности: F-фактора, откуда следовал вывод об односторонности механизма и наличия F+ и F — фенотипов. Дальнейшие исследования показали возможность превращения клеток F — в F+ в смесях клеток обоих типов, что указывало на трансмиссивность F-фактора. Было также доказано существование внехромосомных элементов – «плазмид». Как оказалось позднее, плазмида (фактор) F является чистым фактором генетического переноса, так как обладает лишь генами переноса и генами репликации.

Внехромосомная природа фактора F была доказана на основании результатов обработки бактерий F+ акридиновыми красителями, что приводит к «удалению» фактора F из клеток популяции и превращает их из доноров в реципиентов (Hirota, Jidjima, 1956; Lederberg, 1958; Wollman, Jacob, 1956).

Открытие во второй половине 50-х годов японскими исследователями генетических элементов, контролирующих множественную трансмиссивную устойчивость бактерий к наиболее широко применявшимся антибиотикам и синтетическим химиотерапевтическим препаратам сульфаниламидного ряда, ознаменовало новый этап в изучении внехромосомных факторов наследственности бактерий (Watanabe, 1963; Mitsuchashi, 1960, и др.). Она передавалась в результате клеточных контактов, независимо от переноса бактериальной хромосомы. Для обозначения детерминантов лекарственной резистентности Mitsuhashi S. предложил символ R.

В России исследования плазмид были начаты в конце 50-х гг. в лабораториях Д. Г. Кудлай и А. П. Пехова.

Классификация

Существует несколько систем классификации плазмид, базирующихся на:

1. Топологии (суперспирализованные, линейные или кольцевые);

2. Механизмах репликации;

3. Маркерных генах, содержащихся на плазмидах круге хозяев;

4. Копийности;

5. Конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные;

6. Функции.

Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репли

1. По топологии плазмид

Плазмиды – молекулы ДНК, с размерами от 1 350 МД и более (1000 550000 нуклеотидов). Чаще всего размеры лежат в пределах от 3 6 МД и от 50 70 МД (последнее множество размеров принадлежит конъюгационнымплазмидам).

По морфологическому строению выделяют кольцевую, линейную и суперспирализованные формы (Рисунок 1).

Молекуле плазмидной ДНК присущи различные конформации: может быть двух-цепочечная кольцевая форма (в результате смыкания одной из цепей ДНК – «релаксированная» форма), в результате смыкания обеих цепей образуется ковалентно закрытая сверхспиральная кольцевая форма.

Рисунок 1. Конформацииплазмидной ДНК: 1) суперспирализованная, 2) линейная и 3) кольцевая релаксированная.

Для большинства бактерий и плазмид обычна суперспирализированная форма. У микроорганизмов ряда видов встречаются плазмиды в линейной форме, например, у стрептомицетов – плазмида SCP1.

Значительная часть сверхспиральной ДНК отдельных плазмид находится в «релаксационном» комплексе с белком.

Кольцевая форма молекулы ДНК плазмиды характерна лишь для бактерий, но не для грибов и растений, где она существует в линейной форме.

2. Механизм репликации

Существует три основных механизма репликации кольцевых плазмид: тета- (Θ)-репликация, репликация с вытеснением цепи и репликация по типу «катящегося кольца».

1. Тета-(Θ)-репликация(Рисунок 1). При этом типе происходит:

1.Расщепление водородных связей между цепями и расплетение двойной спи-

рали ДНК, то есть катализируется белками Repи DnaAи/или в ходе начала транскрипции плазмиды РНК-полимеразой;

2.Синтез праймерной РНК (пРНК);

3.Инициация синтеза ДНК на праймере, путём его ковалентной модификации — присоединения комплементарных нуклеотидов к 3’-концу.

 Рис. 1. Тета-репликация:общая схема.

Тета-репликация может начинаться в одной или нескольких точках oriи быть одно- и двунаправленной. Своё название этот механизм получил благодаря сходству молекулы плазмиды, реплицирующейся по данному механизму, с греческой буквой тета (Θ). Репликация ДНК происходит непрерывно на лидирующей цепи и прерывисто на отстающей (запаздывающей) цепи.

В итогеэтого метода получаются две кольцевые двухцепочечныеплазмиды.

2. Репликация с вытеснением цепи(Рисунок 2). При этом методе происходит расплетение двойной спирали хеликазами, а затем синтез новой цепи (или цепей) с вытеснением родительской.

Рисунок 2. Репликация с вытеснением цепи: (A)однонаправленная; (B)двунаправленная.

Этапы репликации:

1.Репликация начинается с присоединения белка RepCк итеронам точки oriплазмиды. ХеликазаRepAсвязывается с обеими цепями в области АТ-повторов (недалеко от сайта связывания RepC) и расплетает двойную спираль ДНК, открывая и активируя ssi-сайты. Однако плавление дуплекса ДНК может быть вызвано и взаимодействием белка RepC с итеронами вблизи ssi-сайтов.

2.ssiAи ssiBявляются участками, на которых непосредственно синтезируются праймеры и начинается репликация.

3.Именно с ssiAи ssiBсвязывается RepB(праймаза). Инициация репликации на любом из ssi-сайтов плазмидной ДНК может происходить независимо. При этом RepAхеликаза во время синтеза вытесняет нереплицируемую цепь ДНК (в виде D-петли).

Продукты репликации «с вытеснением цепи»:

— двухцепочечныесверхспирализованные кольцевые ДНК (дцДНК);

— вытесненные одноцепочечные кольцевые ДНК (оцДНК, в случае однонаправленного синтеза);

— частично двухцепочечные кольцевые ДНК (в случае двунаправленного синтеза).

3. Репликация по механизму «катящегося кольца»(Рисунок 3). Особенность этого механизма в том, что в самом начале процесса одна из родительских цепей разрывается (разрыв фосфодиэфирной связи). В результате образуются свободные 3’- и 5’-концы. К свободному 3’-концу ДНК-полимераза начинает присоединять нуклеотиды по принципу комплементарности.

Этапы репликации:

1.Репликация по данному механизму начинается с того, что закодированный в плазмиде Rep-белок разрывает фосфодиэфирную связь на положительной цепи ДНК. Эта область получила название «двухцепочечной точки ori» (или двухцепочечныйориджин — dso).

2.При разрыве образуется свободный 3′-OH конец, который используется как праймер при синтезе лидирующей цепи (при участии ДНК-полимеразы III, SSB-белкови хеликазы).

3.Элонгация с вытеснением родительской положительной цепи продолжается до тех пор, пока реплисома не достигнет сайта dso, на котором синтез лидирующей цепи завершается с замыканием новой цепи и отщеплением родительской положительной цепи, послужившей праймером при синтезе.

Рисунок 3. Репликация по механизму «катящегося кольца»

Продукты репликации по механизму «катящегося кольца»:

1.Двухцепочечная ДНК (дцДНК), состоящая из родительской отрицательной и синтезированной положительной цепей;

2.Одноцепочечная ДНК (оцДНК), представляющая собой родительскую положительную цепь.

3. Маркерных генах, содержащихся на плазмидах круге хозяев

В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:

1) R-плазмиды. Обеспечивают лекарственную устойчивость; могут содержать гены, ответственные за синтез ферментов, разрушающих лекарственные вещества, могут менять проницаемость мембран;

2) F-плазмиды. Кодируют пол у бактерий. Мужские клетки (F+) содержат F-плазмиду, женские (F—) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Они отличаются поверхностным электрическим зарядом и поэтому притягиваются. От донора переходит сама F-плазмида, если она находится в автономном состоянии в клетке.

F-плазмиды способны интегрировать в хромосому клетки и выходить из интегрированного состояния в автономное. При этом захватываются хромосомные гены, которые клетка может отдавать при конъюгации;

3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;

4) Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;

5) плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты, с помощью которых бактерии могут утилизировать ксенобиотики.

Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.

6. Функции плазмид

Функции плазмид в клетке чрезвычайно разнообразны. К ним относят:

· перенос генетического материала при конъюгации — F-плазмида;

· плазмидыбактериоциногенности контролируют синтез белков, летальных для других бактерий — Col-плазмиды;

· синтез гемолизинов — Hly-плазмиды (являются конъюгативными);

· устойчивость к тяжёлым металлам;

· устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды);

· синтез энтеротоксинов — Ent-плазмиды;

· устойчивость к УФ-излучению;

· синтез антигенов, обеспечивающих адгезию бактерий на клетках в организме человека и животных — плазмиды антигенов колонизации;

· система рестрикции-модификации;

Метод выделения плазмид

          Для выделения плазмид разработано несколько методов. Они различаются по чистоте конечного продукта, скорости выделения и возможности их использования для выделения плазмид из большого («maxiprep») и промежуточного («midiprep») объемов бактериальной культуры или для одновременного выделения плазмидной ДНК из большого числа культур малого объема («miniprep»).

         Почти всегда для выделения плазмид используют культуры, растущие в содержащей соответствующий антибиотик жидкой среде и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии. Если плазмидные векторы (например, pUC) реплицируются в клетке с образованием большого числа копий, то соответствующие плазмиды можно получить в больших количествах из культур, выращенных в стандартной LB-среде до достижения поздней логарифмической фазы (примерно 18 ч). Однако если используемый вектор реплицируется не столь бесконтрольно (как, например, плазмида pBR322), его приходится селективно амплифицировать инкубацией бактериальной культуры в течение нескольких часов в среде с хлорамфениколом (170 мкг/мл). Хлорамфеникол ингибирует синтез белков клетки-хозяина и тем самым нарушает репликацию бактериальной хромосомы. При этом репликация плазмид продолжается еще в течение нескольких часов, что позволяет значительно увеличить выход плазмидной ДНК по сравнению с не амплифицированными культурами.

       Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами.

Все они включают три основных этапа:

1. Рост бактерий и амплификацию плазмиды;

2. Сбор бактерий и их лизис;

3. Очистку плазмидной ДНК.

     Амплификацию плазмид производят при выращивании бактерии-хозяина в богатой среде в присутствии хлорамфеникола. Ночную культуру (10 мл LB c добавлением антибиотика) пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в 25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют пока культура не достигнет поздней логарифмической фазы (D600=0,6).

     Переносят культуру в свежую среду LB с антибиотиком (500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титр удваивается), добавляют антибиотик до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 12-16 ч.

    Метод щелочного лизиса клеток бактерий, разработанного Бирнбоймом и Доли в 1979 году (Birnboim, Doly, 1979). Этот способ позволяет легко отделить плазмидную ДНК от высокомолекулярной хромосомной ДНК. для последующего выделения биологически активной ДНК можно добиться разными способами.

- Механические. При этом происходят многочисленные разрывы ДНК.

- У многих бактерий наступает лизис после добавления анионного детергента додецилсульфата (или лаурилсульфата). В частности, так можно разрушить бактерии кишечной группы, пневмококки и гемофильные бактерии. Додецилсульфат не только разрушает клетки, но и денатурирует некоторые белки. Однако затем он должен быть полностью удален из лизата (что и достигается при последующих обработках), так как его примесь в трансформирующей ДНК мешает самому процессу трансформации.

- Некоторые грамположительные бактерии нельзя разрушить только додецилсульфатом или другими поверхностно-активными веществами. Вначале нужно удалить клеточную стенку и затем применить тот или иной детергент. Для разрушения клеточной стенки чаще всего применяют лизоцим. При концентрациях, которые чаще всего применяются для разрушения бактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функции лизоцима сводятся к разрушению клеточной стенки, в результате чего образуются хрупкие протопласты, легко разрушаемые детергентами. При больших концентрациях лизоцим может, видимо, влиять на связь ДНК с цитоплазматической мембраной и даже связываться с ДНК, осаждая ее. Кроме лизоцима, для той же цели употребляют проназу. Проназа способствует более полному гидролизу белка и поэтому лучшей последующей депротеинизации ДНК.

       При разрушении бактерий в лизате в числе прочих ферментов появляются дезоксирибонуклеазы. Они, если действие их чем-либо не блокировано, могут тут же разрушить ДНК. Обычно от них защищаются, добавляя вещества, которые связывают ионы магния, требующиеся для работы большинства ДНКаз.

      Вещества, связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат), которые добавляют при лизисе клеток для инактивациидезоксирибонуклеаз и предохранения выделяющейся ДНК, подавляют поглощение ДНК компетентными клетками. Додецилсульфат и дезоксихолат также подавляют трансформацию. Лизоцим и проназа, остающиеся в лизате, сами могут лизировать компетентные клетки. В ряде случаев от нежелательных примесей, мешающих трансформации, можно избавиться за счет его разведения.

       Для депротеинизациилизата при выделении ДНК используют обработку фенолом, который осаждает додецилсульфат и инактивирует все белки, в том числе и дезоксирибонуклеазы.

ЭДТА – разрыхляет наружнюю мембрану, ингибирует нуклеазы лизоцим – разрушает клеточную стенку SDS- разрушает цитоплазматическую мембрану, денатурирует белки, ингибирует нуклеазы

      Существуют различные методики лизиса. Лизис кипячением (Holmes, Quigley, 1981) и лизис щелочью (Birnboim, Doly, 1979), отличаются высокой эффективностью и в случае малых плазмид (≤10 kb) дают выход 2-3 мг/л. Лизис под действием SDS (Godson, Vapnek, 1973) сравнительно более мягкий, и им следует пользоваться в случае больших плазмид (≥10 kb).

Очистка ДНК

        В этих методах очистки так или иначе используют два основных различия между ДНК Escherichiacoli и плазмидной ДНК: 1) хромосома E. coli по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов; 2) основная масса ДНК E. сoli выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул. Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК E. coli, случайно захваченные обломки лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативнуюконформацию, тогда как ДНК E. coli остается денатурированной. Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК E. coli также и при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистый этидий или дийодистыйпропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и поэтому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантной ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующимиэндонуклеазами, лигирование, трансформация и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее препараты (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНКили когда нужно пометить 5`-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

        Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бактерий. Вообще говоря, чем меньше плазмида, тем лучше достигаемые результаты. С увеличением молекулярной массы плазмиды ее свойства становятся все ближе к свойствам ДНК хозяина. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все плазмиды, обычно используемые при клонировании, относительно невелики и приведенные ниже методы дают хорошие результаты.

Суть метода щелочного лизиса.

     Большинство методов выделения плазмид основаны на том, что плазмиды имеют ковалентно замкнутую кольцевую форму (ССС) и гораздо меньшие размеры, чем бактериальная хромосома. Бактериальные клетки собирают центрифугированием и лизируют с помощью ЭДТА, разрушающего клеточную стенку.

     Метод щелочного лизиса основан на том, что в щелочных условиях при рН ~ 12 происходит денатурация только линейных молекул ДНК (двухцепочечной геномной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов. Часть клеточной РНК и белков тоже осаждаются вследствие того, что при осаждении используется детергент додецил-сульфат натрия.

Дополнительно для удаления РНК используют РНК-азу, а для расщепления белков используют щелочную протеазу. После удаления осадка геномной ДНК, РНК и белков путем центрифугирования, проводят дальнейшую очистку плазмидной ДНК.

      Количественное определение ДНК с помощью спектрофотометрии.

      Количественное содержание ДНК, РНК, олигонуклеотидов и даже мононуклеотидовможет быть определено непосредственно в водном растворе в разведенном, или неразведенном виде путем измерения величины поглощения А (также определяемой,как оптическая плотность, OD) в ультрафиолетовом свете (а также и в видимой частиспектра). Если определяемый образец достаточно очищен (то есть, без значительногоколичества примесей, таких как белки, фенол или агароза), спектрофотометрическоеопределение количества ультрафиолетового света, поглощаемого основаниями,является простым и точным. Для этого метода идеальным является буфер с низкойионной концентрацией (например, ТЕ буфер).

      Концентрация нуклеиновых кислотобычно определяется при длине волны 260 нм, в сравнении со стандартнымраствором. Влияние примесей на результат может быть выявлено по вычислению«отношения» на чистоту полученного образца. Так как белки поглощают при длине волны 280 нм, отношение А260/А280 может свидетельствовать о степени чистоты препарата.

Суть метода агарозного электрофореза ДНК.

    Электрофорез ДНК - один из основных инструментов в молекулярной биологии.

Метод используется для:

--разделения молекул ДНК и РНК по их размеру и определение размера по

Маркеру;

- определения примерного количества ДНК по яркости свечения;

- вырезания нужной ДНК из геля и использовать в дальнейшем;

- анализа результатов проведения ПЦР, а также для других целей;

Разделение фрагментов ДНК происходит из-за наличия у них заряда. Фосфатные остатки у нуклеотидов придают всей ДНК негативный заряд. Это делает ее растворимой в воде и заставляет двигаться под действием тока к положительному электроду. Чтобы ДНК двигалась медленнее, ее помещают в вязкую среду, в агарозный гель. Увеличение концентрации агарозы в геле уменьшает скорость миграции ДНК и позволяет разделять малые ее фрагменты.

          Для выделения плазмид разработано несколько методов. Они различаются по чистоте конечного продукта, скорости выделения и возможности их использования для выделения плазмид из большого («maxiprep») и промежуточного («midiprep») объемов бактериальной культуры или для одновременного выделения плазмидной ДНК из большого числа культур малого объема («miniprep»).

         Почти всегда для выделения плазмид используют культуры, растущие в содержащей соответствующий антибиотик жидкой среде и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии. Если плазмидные векторы (например, pUC) реплицируются в клетке с образованием большого числа копий, то соответствующие плазмиды можно получить в больших количествах из культур, выращенных в стандартной LB-среде до достижения поздней логарифмической фазы (примерно 18 ч). Однако если используемый вектор реплицируется не столь бесконтрольно (как, например, плазмида pBR322), его приходится селективно амплифицировать инкубацией бактериальной культуры в течение нескольких часов в среде с хлорамфениколом (170 мкг/мл).

Хлорамфеникол ингибирует синтез белков клетки-хозяина и тем самым нарушает репликацию бактериальной хромосомы. При этом репликация плазмид продолжается еще в течение нескольких часов, что позволяет значительно увеличить выход плазмидной ДНК по сравнению с не амплифицированными культурами.