Г)Оптическое вращение и круговой дихроизм.

Оптические (спектральные) методы исследования биомакромолекул

А) Метод светорассеяния является в настоящее время одним из основных физико-химических методов определения молекулярного веса и средних размеров макромолекул в растворах. В его основе лежит строгая и хорошо экспериментально проверенная физическая теория.

Метод является абсолютным, т. е. не нуждается в калибровке с привлечением других методов и не требует предварительных предположений о структуре исследуемых макромолекул. Метод использует сравнительно несложную и недорогую аппаратуру и имеет весьма широкий диапазон применения. В то же время метод светорассеяния, в значительно большей степени, чем другие оптические методыисследования полимеров, требует заботы о тщательной очистке растворов перед измерениями, вплоть до разработки специальных приемов очистки. 
    Под действием центробежной силы происходит расслоение раствора на отдельные фракции, отличающиеся по величине содержащихся в них макромолекул. Концентрация полимера в слоях раствора различна, так как вес отдельных фракцийполимера различен. Оптическим методом можно установить концентрацию полимера в каждом слое раствора, сопоставляя результат оптических исследований с аналогичными измерениями растворовданного полимера известной концентрации.
    В меньшей мере используются оптические методы, основанные на исследовании вторичного излучения (люминесценции). Метод поляризованной люминесценции позволяет по частичной поляризации излучаемого полимером света изучать релаксационные переходы в блочных полимерах и конформации макромолекул в растворах.

При использовании этого метода в исследуемый полимер вводятся люминесцирующие метки, которые улучшают регистрацию интенсивности свечения. Размеры частиц коллоидных систем соизмеримы с длиной световых волн, поэтому, кроме общих для всех растворов явлений преломления и поглощения света в различных областях спектра, коллоидные растворы обладают также рядом своеобразных оптических свойств. Благодаря тесной связи оптических свойств с внутренним строением и формой коллоидных частиц, а также вследствие удобства и точности оптических методов измерений, они в настоящее время относятся к числу основных методов исследованияколлоидных систем, в частности, при определении концентрации, размеров и формы дисперсных частиц и макромолекул.

Б) Поляриметрия.Другой метод, широко используемый в последнее время для исследования макромолекул,— поляриметрия. Этот метод применим лишь для оптически активных веществ, каковыми, например, является большинство важных макромолекулживых организмов. Оптическая активность чрезвычайно чувствительна к конформационным переходам и является неоценимой для исследования переходов спираль — клубок. За последние годы получено все возрастающее число синтетических оптически активных полимеров, что позволяет воспользоваться специфическими возможностямиполяриметрии для дальнейшего развития представлений о поведении растворенных цепных молекул в целом.

В) Рентгеноструктурный анализ.

Этот метод основан на явлении дифракции рентгеновских лучей.

Дифракция – огибание волной препятствия – происходит, когда l сравнима с размером объекта. По этой причине для исследования молекул используются рентгеновские лучи, l ~ размерам атома. Получая дифракционную решётку, можно по картине судить о структуре макромолекул.

Г)Оптическое вращение и круговой дихроизм.

Оба метода основаны на пропускании через образец монохроматического поляризованного света.

Особенно методы ДОВ и КД используются в органической химии, биохимии, энзимологии и молекулярной биологии. Данными методами исследуются белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, стероиды, углеводы и полисахариды, вирусы, митохондрии, рибосомы, фармакологические средства, синтетические полимеры, координационные соединения, неорганические и редкоземельные комплексы, кристаллы, суспензии и пленки и т. п.

Дисперсия оптического вращения (ДОВ) оценивается по углу поворота плоскости поляризации вышедшего света по сравнению с падающим. Основной вклад в неё вносят a – спирали белков и по величине дисперсии можно оценить содержание a – спиралей в белках (зависимость угла поворота a от l).

Вращение плоскости поляризации чрезвычайно чувствительно к изменению конформациибелковых молекул. Правда, между оптической активностью и структурой белка нет простой и ясной зависимости, но значение оптической активности как характеристики степени конформационного изменения белков общеизвестно и играет большую роль при изучении процессов денатурации Например, исследование углеводородов на конформационное состояниемакромолекул глобулярных белков проводились методами оптического вращения и его дисперсии, вискозиметрически, спектрофотометрически и по изучению кинетических параметров ферментативной активности,

Круговой дихроизм (КД):

Его величина определяется в разнице поглощения образцом право – и лево – поляризованного света. Разница объясняется различными коэффициентами молярнойэкстинции для право – и лево – поляризованного света и позволяет определить направление, в котором ʼʼзакрученаʼʼ спираль – зависит [Q]_l от l.

Для каждой хромофорной группы аминокислот, существует точка пика поглощения, преимущественно в УФ области (230 – 310 нм)

Простой абсорбционный спектр, таким образом, может позволить исследовать аминокислотный состав белка.

a – спираль

b – спираль

клубок

По структуре КД (кругового дихроизма) можно определить доли глобулярных и фибриллярных участков и неупорядоченных структур.

С помощью этих методов решаются следующие задачи:

1) определение по эмпирическим правилам конформации и ее изменений под действием различных физико-химических воздействий

2) изучение механизма и кинетики химических реакций (особенно ферментативных)

3) получение стереохимических характеристик

4) измерение концентраций оптическиактивных веществ

5) определение спиральности макромолекул

6) получение электронныххарактеристик молекул

7) исследование влияния низких температур на конформацию соединений

8) влияние фазовых переходовтипа твердое тело — жидкость — газ на изменение структуры.

Поглощение излучения растворами, содержащими макромолекулы или низкомолекулярные растворенные вещества, можно исследовать в трех участках электромагнитного спектра, соответствующих различным типам поглощения излучаемой энергии системой. В области видимого и ультрафиолетового (УФ) света излучение вызывает возбуждение электронов. Органические молекулы поглощают видимый свет лишь в том случае, если они содержат большие резонирующие системы. Однако в некоторых случаях сильное поглощение видимого света обусловлено образованием комплексов ионов переходных металлов с макромолекулами, как, например, при исследовании гемоглобина и других белков, содержащих железо-порфириновый комплекс, связанный с макромолекулой. Спектральное поглощение в инфракрасной области возникает в результате переходов между вращательными и колебательными уровнями. Как УФ-, так и ИК-спектроскопия являются мощными средствами анализа полимеров. Такой анализ основан на предположении, что вклады, вносимые мономерными остатками в измеряемую оптическую плотность, аддитивны. Совершенно иным является положение для поглощения в радиочастотной области, вызванного квантованными переходами в ориентации магнитных моментов некоторых атомных ядер во внешнем магнитном ноле. Разрешение, достигаемое при исследовании методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), значительно выше для жидких образцов, чем для твердых.

Д) Двойное лучепреломление полимеров. С двойным лучепреломлением полимеровсвязано возникновение явления фотоупругости (в механическом поле), эффекта Керра(в электрическом поле) и эффекта Коттона—Мутона (в магнитном поле). Эффект Коттона — Мутона (или эффект Фохта) — явление возникновения под действием магнитного поля в оптически изотропных средах двойного лучепреломления. Впервые обнаружено в коллоидных растворах Дж. Керром и (независимо от него) итальянским физиком К. Майораной в 1901 г. Назван в честь подробно исследовавших его в 1907 году французских физиков А. Коттона и Г. Мутона.

Фотоупругость полимеров зависит от их фазового и физического состояния. Метод фотоупругости используется для изучения характерараспределения внутренних напряжений в полимерах без их разрушения.

Изучая эффект Керра в полимерах, можно оценить эффективную жесткостьполярных макромолекул, мерой которой служит корреляция ориентаций электрических диполейвдоль цепей. При исследовании белкаэкспериментально определяютскорость движения макромолекул в электрическом поле. Поскольку отдельные макромолекулы увидеть нельзя, измеряют скоростьперемещения фронта окрашенного белка в растворителе. Положение этого фронта, называемого границей, регистрируется оптическими методами. Первый электрофоретический аппарат с оптическим устройством, предназначенным для точного измерения скорости движения границ, сконструировал А. Тизелиус(АрнеТиселиус (швед.Arne Wilhelm Kaurin Tiselius; 10 августа1902, Стокгольм — 29 октября1971, Уппсала) — шведский биохимик, член Шведской АН и её президент с 1956 года. Лауреат Нобелевской премии (1948)) за эту работу он был удостоен Нобелевской премии.

Наблюдение эффектаКоттона — Мутона (проявление дихроизма в магнитном поле), обусловленного диамагнитной восприимчивостью и анизотропией тензораоптической поляризуемости, позволяет оценивать значения коэффициентов вращательного трениямакромолекул полимеров. Другой метод исследования заключается в использовании оптически неактивных катионных красителей, при связывании которых со спиралью поли-7-глутаминовой кислоты появляется сильный эффектКоттона. При этом кривая дисперсии пересекает линию нулевоговращения вблизиполосы поглощения красителя. Для поли-О-глутаминовой кислоты такжеможно получить подобный, но противоположный по знаку, эффект Коттона, который исчезает при переходе от спирали к хаотической конформации, несмотря на то что краситель остается связанным с макромолекулой. Белки, в состав которых входят гемогруппы, содержащие железо (миоглобин, гемоглобин, каталаза, пероксидаза), обладают своим собственным красителем, и в их спектрах наблюдаетсяэффект Коттона в видимой области, т. е. в области поглощениягема. При денатурации этот эффект исчезает, но поглощение в видимой области при этом сохраняется. При добавлении оптически неактивного восстановленного никотинадениндинуклеотида к алкогольдегидрогеназе из печени (ферменту, содержащему цинк) наблюдается эффектКоттона в области поглощения нуклеотида. Однако в этом случае эффект Коттона обусловлен, по-видимому, асимметрией связывающей поверхности фермента, а не асимметрией спирали. Аналогичным примером могут служить комплексы оптически активных аминокислот (не поглощающих видимого света) с медью. В полосе поглощениямедных комплексов, уже находящейся в видимой области, наблюдается эффектКоттона, индуцируемый аминокислотами.

Д) Флуоресцентная спектроскопия белков.

а) Собственная флуоресценция белков, имеющих в составе аминокислоты: Tyr, Try, Phe, и по спектру флуоресценции можно судить о положении этих остатков в белке, и взаимодействие его с окружающими группами.

l_ф чистого Tryравна 323 нм, в его вариации в белках от 320 – 342 нм.

б) ʼʼТушениефлуоресценцииʼʼ введёнными хромофорами (то есть миграция энергии с белка на ионы Cs⁺, J^-, акриламид) позволяет оценить доступность хромофорных групп для внешних реагентов.

в) Более удобным в ряде случаев оказывается двухволновой флуоресцентный метод, что позволяет оценить динамику смещения спектра, так как положение максимальной флуоресценции более чувствительно к конформационным перестройкам

г) Флуоресцентная спектроскопия с временным (наносекундным) разрешением (флаш – фотолиз).

Флуоресценция возбуждается наносекундными вспышками лазера, и по повороту угла поляризации измеряется степень поворота хромофорной группы за указанное время. Метод позволяет регистрировать быстрые процессы.