Испытания на цитотоксичность

Испытания токсичности

Испытание на аномальную токсичность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIIIиздание, том I (ОФС.1.2.4.0004.15). Испытание проводили на двух видах животных: белых мышах массой (18-20) г и морских свинках массой (250-300) г. Исходную массу животных определяли и регистрировали в день начала испытаний. В исследованиях были использованы здоровые животные, содержащиеся на регламентированном пищевом рационе, которые ранее не использовались для проведения каких-либо испытаний.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Препарат вводили подкожно по 1,0 мл двум морским свинкам и внутрибрюшинно по 1,0 мл пяти белым мышам со скоростью 0,1 мл/сек.

Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 дней с регистрацией всех изменений в состоянии здоровья каждого животного. Через 1 сутки, 4 дня и в день окончания наблюдения каждое животное взвешивали.

Учет результатов:Испытание считают удовлетворительным, если:

- все животные остаются живыми в течение периода наблюдения;

- ни у одного из животных не выявлены признаки заболевания, интоксикации;

- ни у одного из животных, получивших испытуемый препарат подкожно, не развился некроз или абцесс в месте его введения;

-масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной.

Заключение:

Исследуемый препарат в дозе 1 мл/животное нетоксичен (результаты контроля приведены в приложении к протоколу).

Приложение к протоколу

Результаты контроля токсичности

Испытания на пирогенность

Испытание на пирогенность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIIIиздание, том I (ОФС.1.2.4.0005.15).

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Испытание на пирогенность основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции.Испытуемое инъекционное средство вводили в ушную вену кролика в дозе 1 мл/животное.Перед введением раствор подогревали до 37,0±2 ^оС.Испытание инъекционного средства проводили на группе из трех кроликов и исходной температурой 38,5-39,5 ^оС.Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин, у каждого кролика дважды измеряли температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не превышали 0,2 ^оС. За исходную температуру принимали величину последнего результата измерения. Раствор испытуемого средства вводили животным сразу после второго измерения температуры. Измерения температуры после внутривенного введения испытуемого средства проводили с интервалом не более 30 мин на протяжении трех часов.

Учет результатов:Определяли максимальное изменение температуры (дельта t) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. В соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нуль и не учитывают.

При испытании на 3-х кроликах инъекционное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 ^оС, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 ^оС.

Заключение:Исследуемый препарат в дозе 1 мл/животное непирогенен. Максимальное повышение температуры у кроликов по сравнению с исходным значением составило 0,2 ^оС и индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превысило 0,5 ^оС. Результаты контроля приведены в приложении к протоколу.

Приложение к протоколу

Результаты контроля пирогенности

Испытание на стерильность

Испытание на стерильность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I (ОФС.1.2.4.0003.15).

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3мл. по ,ТУ 9385-059-05664012-2017 экспериментальная серия.

Испытание на стерильность проводили методом прямого посева.

Посевы инкубировали в течении 14 суток при температуре 32,5 ± 2,5^оС в жидкой тиогликолевой среде и при температуре 22,5 ± 2,5^оС в среде Сабуро.

Заключение:Исследуемый препаратстерилен.

Протокол определенияводородного показателя pH

Потенциометрическое определение pH проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I ОФС.1.2.1.0004.15 Ионометрия.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3мл. поТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Измерение проведено на измерителе комбинированном Seven(модификация SevenEasy) в комплекте с электродом, производства MettlerToledoInlabMicro № 3221186.

Перед испытаниями была проведена калибровка pH-метра и электрода по трем стандартам буферным растворам, которые охватывают интервал измерений pHданного препарата.

Заключение: значение pHпредставленного препарата составило 7,2 ед. pH.

Испытания на цитотоксичность

Испытание на цитотоксичность проведено в соответствии сГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro».

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Линия клеток: DK-4 штамм диплоидных клеток из кожно-мышечной ткани эмбриона человека получен из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки фибробластоподобные с ядрами овальной формы. Монослойный способ культивирования. Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы в культуре клеток не обнаружены.

Условия культивирования: Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла  МЕМ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) с 10 % сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в CO2 инкубаторе при 37 ^оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х10⁶ клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3 − 4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 %-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) и 0,02 %-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) в соотношении 1:2.

Контроли. В качестве контролей использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки.Вкачестве препарата сравнения использован «Имплантат для подкожного введения NCTF 135 во флаконах объемом 5мл» производства FilorgaS.A.S. 2-4, ruedeLisbonne 75008 Paris (Франция), Регистрационный номер медицинского изделия ФСЗ 2008/02524, а также препарат «DermahealHSR» производства Caregen (республика Корея).

Клеточный ответ оценивали с помощью МТТ-теста.Исследование цитотоксичности препарата проводили с использованием МТТ-теста. Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х10³ клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37^оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций  (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. Жизнеспособность клеток оценивали по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н- тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma, США) и преобразования его в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Для этого в каждую лунку добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 250 мкг/мл, инкубировали клетки в течение 4 часов, затем растворяли образовавшийся формазан 100 мкл ДМСО. Далее снимали значения оптической плотности субстрата в лунках с помощью на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Scientific) при длине волны 492 нм. Процент жизнеспособных клеток вычисляли по формуле: оптическая плотность раствора опыта / оптическая плотность раствора контроля х 100 %. Статистические отличия рассчитывались с помощью критерия Манн-Уитни в программе Statistiсa 8.

Рис.1. Влияние препаратов на жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека после совместной инкубации в течение 72 часов.

Заключение: Экспериментально доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» не оказывал цитотоксическое влияние на фибробласты человека, напротив показано, что препарат стимулирует пролиферацию клетокв концентрации от 2,8 – 90 % (рис.1). Тогда как, препарат «DermahealHSR» (Caregen, республика Корея) значительно снижал жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека в дозе от 11,25 – 90 % процент жизнеспособных клеток снизился до 40 %.