Значение асептики в биотехнологических процессах

Лекция 7-8-9Значение асептики в биотехнологических процессах и принципы обеспечения асептических условий на производстве

План лекции:

1. Значение асептики в биотехнологических процессах;

2. Основные принципы обеспечения асептических условий на производстве.

Значение асептики в биотехнологических процессах

Биотехнологические процессы, как правило, проводят в асептичных условиях, хотя могут быть исключения для некоторых из них. Например, при культивировании отдельных эукариот (дрожжи) в негерметизированных ферментаторах (нестерильный процесс) происходит заметное снижение pH среды, где доминирующее положение дрожжей не изменяется при попадании контаминирующих бактерий (от лат. contaminatio - загрязнение, заражение, смешение) - они не могут составить конкуренции основному виду.

Асептика - это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные. Следовательно, асептика в биологической технологии и, например, в хирургии - это не одно и то же понятие. В первом случае предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе микроба) и полное исключение попадания других микроорганизмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов и микробов - контаминантов на операционное поле или в рану. Каждый из материальных потоков в биотехнологических процессах - потенциальный источник микробов - контаминантов. Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер (от франц. barbotage - перемешивание) и пр. Следовательно комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости - и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической - обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической - обработка поверхностей химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через посредство которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства.

Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли колеблются в широких пределах. В производственных помещениях это зависит от конструкционных особенностей здания, розы ветров, географической зоны расположения города и предприятия, наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транспорта, количества непосредственно занятых в технологическом процессе людей, характера и локализации складских помещений и т.д. Образующиеся пыль или/и капельки влаги в воздухе, как правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов. Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля, устойчивость которой зависит от размеров (величины) частиц, их электрического заряда и поверхностной энергии. Необходимо помнить, что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток, их отрицательный электрический заряд будет привносить свою долю в общий заряд частицы. Опираясьлишь на величину аэрозоля, содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его: крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную (диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли (диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерной фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе, образуя устойчивую коллоидную систему.

Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для человека не только из-за микробов, находящихся на частицах пыли или капельках жидкости, но и сами по себе вследствие проникновения в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством ее функций. В таком понимании вредными являются следующие аэрозольные частицы: асбеста, алебастра, абразивного порошка, графита, гипса, диоксида титана, дорожной пыли, извести, каолина, корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна и др. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с. По степени загрязненности воздуха микробами и механическими частицами в расчете на 1м³ производственные помещения, в которых асептично изготавливают лекарственные средства, классифицируют по классности следующим образом:

1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха для изготовления стерильных лекарств - не должно быть микробов, а механических частиц размером до 0,5 мкм - не более 3500;

2-й класс чистоты - до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0,5 мкм;

3-й класс чистоты - до 100 микробных клеток (ЗА класс - до 200 и ЗБ класс - до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм;

4-й класс частоты - по ГОСТ 12.1.005 - 86.

Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изготавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматривается.

Лекарственные средства по «микробной чистоте» разделяют на 4 категории: 1) стерильные препараты для инъекций, приготовленные на апирогеннойводе;.

2) глазные лекарства, препараты для введения в закрытые полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых ран не должны содержать живых микроорганизмов - они также относятся к разряду стерильных;

3) лекарственные средства для наружного применения и для введения в открытые полости не должны содержать более 100 живых микробных клеток в 1 г(мл) препарата и при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, а также Pseudomonasaeruginosa и Staphylococcusaureus;

4) все прочие лекарственные средства должны содержать в 1 г (1 мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сап-рофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутствии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Pseudomonasaeruginosa, Staphylococcusaureus, аспорогенные дрожжи рода Candida.

Работающие в помещениях различной степени чистоты должны одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологическую одежду (согласно требованиям системы GMP - см.). Так, в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час 600-200, одевают стерильный костюм, головной убор должен полностью закрывать волосы, включая бороду, и заворачиваться под ворот костюма; на лицо одевается маска во избежание попадания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или продезинфицированную обувь, включая бахилы. Низ брюк подворачивают в обувь (как и рукава костюма - в перчатки). От защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна, а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела оператора. Указанная одежда должна быть разового использования или использоваться в течение одного дня, если результаты проверки подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется постоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стерильную зону желательно проектировать таким образом, чтобы все операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких помещений все открытые поверхности должны быть гладкими, непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезинфекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных выступов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования, раздвижные двери здесь нежелательны из-за возможности скопления пыли в пазах; сточные и канализационные трубы не должны проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необходимо проектировать и строить с воздушными шлюзами, снабжающимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами не должны открываться одновременно; между шлюзами должна быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. visus - зрение, auditus - слух, слышание). Мытье рук и средства для этого должны быть только в комнате для смены одежды.

В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух под положительным давлением.

В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена воздуха 20-60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяющий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног; на голову необходимо одевать шлем-капюшон, полностью закрывающий волосы, нос и подбородок; на лицо - маску, не отделяющую ворса; на руки - резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки, на ноги - стерильную или продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется одевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона - в перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования нижнего белья не должна быть открыта.

В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена воздуха 1-15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса комбинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и маску.

В помещениях четвертого класса чистоты рекомендуется одевать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей. Люди, занятые в биотехнологическом производстве, также могут быть источником контаминирующей микрофлоры - граммотрицательных бактерий, кокков, микоплазм, вирусов и др. Только на поверхности кожи может сосредоточиваться до 10¹⁰ микробных клеток. Наиболее загрязненными являются кисти рук, ступни, локти, шея, грудь, промежность, паховые области. Разнообразна и многочисленна микрофлора ротовой полости: бактериальные и кокковые формы, вибрионы, спириллы и спирохеты, нокардии, дифтероиды, протозойные организмы, аспорогенные дрожжи рода Candida, микоплазмы, вирусы и др. При разговоре, кашле, чихании микробы в большом числе попадают в воздух. Установлено, что здоровый человек за одно чихание выделяет до 20000 микробных клеток, способных распространяться по горизонтали, в среднем, до 1,5 м. Капельки носовой слизи, слюны и мокроты, подсыхая, образуют частицы, покрытые белковой или гликопротеиновой оболочкой, и содержащие микробные клетки. В таких частицах микроорганизмы длительно сохраняются и могут являться причиной нестерильности материалов (объектов) на каких-либо технологических операциях.

Источником микробов-загрязнителей могут быть некоторые компоненты питательных сред, например, кукурузный экстракт (фаги, дрожжи и др.).

Растительные вирусы часто выявляются в культурах каллусных тканей; высокую озабоченность в этом смысле вызывают также культуры клеток животных тканей и клеток человека, будучи исключительно благоприятными средами для контаминирующей микрофлоры. [4]