Масс-спектрометрия и инфракрасная спектроскопия

Кафедра товароведения и экспертизы товаров

Рудик Владислав Александрович

Определение ГМО методом спектроскопии: теоретические основы и необходимые условия

РЕФЕРАТ

специальность «товароведение и экспертиза товаров в таможенной деятельности» очной формы обучения

г. Владивосток

 2018

Оглавление

Методы определения ГМО в пищевых продуктах 3

Масс-спектрометрия и инфракрасная спектроскопия 6

Методы определения ГМО в пищевых продуктах

    Генно-инженерно-модифицированные организмы в соответствии с Федеральным законом Российской Федерации «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» представляют собой организмы, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов. Распространенное понятие ГМИ (генетически модифицированный источник) пищи имеет более узкую направленность и относится только к пищевым продуктам или их компонентам, полученным из генетически модифицированных растений.

    Залогом грамотного и своевременного информирования населения о продукции, содержащей ГМО, является не только увеличение числа подвергаемых контролю проб, созданию новых испытательных лабораторий, но и совершенствование действующих методик определения ГМО в пищевых продуктах. Сложившаяся на отечественном и зарубежных рынках ситуация стимулирует развитие и применение самых современных аналитических методов, которые позволяли бы не только обнаруживать ГМО, определять их линию (то есть проводить скрининг) и количественное содержание в продукте.     Поэтому в настоящее время увеличивается число отечественных аккредитованных лабораторий, способных тестировать генетически модифицированные источники. Из сущности генетической модификации следует, что у исследователя есть три объекта, по которым он может судить, является ли данный организм или пищевой продукт генетически модифицированным. Этими объектами являются: – встроенная (чужеродная для данного организма) последовательность ДНК и вспомогательные последовательности (промоторы); – мРНК, матрицей для синтеза которой служила встроенная ДНК; – полипептидная цепь, код последовательности которой содержался во встроенной ДНК (белок).

    Наибольшее число методов основано на детекции именно нуклеиновых кислот, а общее количество методов определения ГМО превышает 200. Молекула ДНК представляет собой наиболее удобный объект для анализа на наличие ГМО. Основное еѐ преимущество перед другими макромолекулами – стабильность. ДНК не разрушается даже при автоклавировании и переносит длительное хранение.

    Самымраспространѐнным методом определения ГМО является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Именно ПЦР отдаѐтся предпочтение в качестве основополагающего метода определения ГМО в России, гармонизированного с международными стандартами.

    При этом биологический материал проверяется на наличие в его составе участка определенной генетической информации путем избирательной амплификации (amplification – увеличение, усиление) нужного участка ДНК в миллионы раз в течение нескольких часов. В 1997 г. швейцарский ученый Pietsch с немецкими коллегами апробировал метод и для пищевой продукции, впервые определив 35S-промотор и nosтерминатор. В качестве стартового материала при ПЦР могут использоваться сложные смеси любого ДНК-содержащего материала, как, например, в мясных и мясосодержащих рубленых полуфабрикатах или молочных продуктах.

    Сущность метода заключается в подборе участков ДНК, характерных только для генетически изменѐнного организма (источника) и последующим цепным размножением этих участков в исследуемом генетическом материале – амплификацией. Такими участками являются структуры 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, nos- и ocs-терминаторы Agrobacteriumtumefacience, маркерные гены gus и nptII различного бактериального происхождения. Ограничиваются эти участки особыми олигонуклеотитидными фрагментами – праймерами, специфическими для каждого отдельного генетического изменения.

    Анализ на наличие ГМО методом ПЦР осуществляется в три этапа:

1. Выделение ДНК из пробы.

2. Амплификация, то есть многократное увеличение содержания интересующих фрагментов ДНК в пробе под действием соответствующих ферментов.

3. Детекция продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза. От начала анализа до получения результата проходит не более 4 – 6 часов.

    К ПЦР-лаборатории предъявляются довольно жѐсткие требования, в частности необходимы три помещения (для пробоподготовки, амплификации и детекции методом электрофореза), не сообщающихся друг с другом, чтобы исключить возможность загрязнения реактивов и оборудования фрагментами ДНК. Работать следует в одноразовых перчатках, заменять одежду и обувь при перемещении из одного помещения в другое.

    Несмотря на это, на сегодняшний день ПЦР является самым удобным и распространѐнным методом определения наличия ГМО в продукте, доступным как в качественном виде (есть или нет ГМО в пробе), так и в количественном (ПЦР в реальном времени, real-time PCR).

    Кроме методов, основанных на анализе РНК и ДНК, большое распространение получили методы, основанные на определении белковых продуктов экспрессии генов, введѐнных в трансгенные растения. Один из популярнейших методов – ELISA (EnzimeLinkedImmunosorbentAssay), позволяющий определять наличие в смеси определѐнного белка при помощи антител, конъюгированных с ферментом. Активность этого фермента определяет цветную реакцию с субстратом, а изменение окраски в системе регистрируется фотоколориметром. Однако данный метод не позволяет анализировать продукты, подвергшиеся в процессе производства термической обработке.

    Кроме того, в некоторых западных лабораториях используют такие методы, как блоттинг и гибридизацию с олигонуклеотидами, а также масс-спектрометрию, хроматографию, инфракрасную спектроскопию, однако их применение требует много времени и сотрудников особой квалификации. Таким образом, использование генно-инженерно-модифицированных организмов в продуктах питания на достигнутом этапе развития знаний о них должно находиться под неустанным контролем со стороны государственных структур, а потребителей необходимо информировать о наличии ГМО в продуктах питания.

Масс-спектрометрия и инфракрасная спектроскопия

    Масс-спектрометрия - это физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду. Этот метод, сегодня рутинно используемый в тысячах лабораторий и предприятий мира, имеет в своей основе фундаментальные знания природы вещества и использует основополагающие физические принципы явлений.

    Приборы, которые используются в этом методе, называются масс- спектрометры или масс-спектрометрические детекторы. Эти приборы имеют дело с материальным веществом, которое как известно, состоит из мельчайших частиц - молекул и атомов. Масс-спектрометры устанавливают что это за молекулы (то есть, какие атомы их составляют, какова их молеклярная масса, какова структура их расположения) и что это за атомы (то есть их изотопный состав).

    Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет их массы, вернее соотношение массы к заряду.

    Первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, превра- тить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией и по разному осуществляется для органических и неорганических веществ. В органических веществах молекулы представляют собой определенные структуры, образованные атомами.

    Масс-спектрометрия дала в руки исследователей инструмент, позволяющий идентифицировать белки, определять какие изменения произошли с их структурой вследствие различных взаимодействий, при их воспроизводстве, определить пути метаболизма различных соединений и идентифицировать метаболиты, разрабатывать новые целевые лекарственные средства. Масс-спектрометрия решает все эти и многие другие задачи аналитической биохимии и генной инженерии.

    Инфракрасная (ИК) спектроскопия является одним из самых распространенных методов молекулярной спектроскопии и занимается изучением колебательных спектров молекул. Эти спектры определяются строением молекулы и связаны с переходами между колебательными энергетическими состояниями или в классической интерпретации, с колебаниями атомных ядер относительно равновесных положений.

    Число и частоты полос зависят, во-первых, от числа образующих молекулу атомов, масс атомных ядер, геометрии и симметрии равновесной ядерной конфигурации, и во-вторых, от потенциального поля внутримолекулярных сил. Таким образом, колебательные спектры являются чрезвычайно специфическими и чувствительными характеристиками молекул, чем и объясняется широкое применение их в химических исследованиях.

    Метод ИК-спектроскопии может быть эффективно использован для изучения свойств поверхности дисперсных окисных систем. Основным преимуществом метода является возможность получения информации практически обо всех возможных состояниях, присутствующих на поверхности: поверхностных гидроксильных группах, кислороде и координационно ненасыщенных катионах. В спектрах надежно идентифицируется неоднородность каждого из типов центров, обусловленная полидисперсностью окислов и связанным с этим выходом различных граней кристаллической решетки, а также возможной дефектностью образцов.

    Метод ИК-спектроскопии применяется в генной инженерии относительно недавно но зарекомендовал себя как один из самых эффективных.