I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАНЯТИЯ

Занятие 1

Тема: Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащие ПОЛИСАХАРИДЫ

Цель:сформировать умения и практические навыки в определении подлинности и доброкачественности лекарственного растительного сырья, содержащего полисахариды.

I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАНЯТИЯ

Полисахариды (гликаны) — природные высокомолекулярные биологически активные вещества, состоящие из остатков моносахаров и их производных (уроновых кислот), связанных О-гликозидными связями.

Полисахариды делятся на две группы: гомополисахариды и гетерополисахариды (схема 1). Гомополисахариды — это полисахариды, которые при гидролизе образуют только один моносахар (например, крахмал, целлюлоза). Гетерополисахариды — это полисахариды, которые при гидролизе образуют разные и продукты их окисления (уроновые кислоты). К ним относятся слизи, камеди и пектиновые вещества.

Схема 1. Классификация полисахаридов (по В.Н. Ковалеву, 2003)

Физико-химические свойства полисахаридов.В чистом виде это аморфные, редко кристаллические, высокомолекулярные вещества. Полисахариды имеют большое количество свободных гидроксильных групп, поэтому они полярны и нерастворимы в спирте и органических растворителях. Растворимость полисахаридов в воде различная: некоторые линейные гомогликаны (целлюлоза, хитин, ксиланы, маннаны) в воде не растворяются вследствие прочных межмолекулярных связей; сложные и разветвленные полисахариды растворяются в воде (гликоген, декстраны) или образуют студни (пектины, агар, кислоты альгиновые и т. п.). В растворах гликаны иногда образуют структурированные системы и могут выпадать в осадок.

Выделение полисахаридов. Для извлечения полисахаридов из природного сырья используют горячую или холодную воду (слизи, некоторые полисахариды бактерий, сульфированные галактаны, фруктаны и т. п.), растворы кислот или щелочей. Для очистки экстракта от белков, минеральных солей, водорастворимых красителей используют диализ, дробное осаждение спиртом или четвертичными аммониевыми основаниями, ультрафильтрацию, ферментолиз и пр. Очистить полисахариды от белков можно денатурацией или избирательной сорбцией на кальция фосфате, бентоните и пр.

Вещества, которые сопровождают клетчатку (гемицеллюлозы, лигнин, минеральные соли), растворяют при нагревании в растворе щелочи, кислот сернистой или азотной. После этого остается чистая целлюлоза.

Качественные реакции.Многообразие полисахаридов, их способность образовывать гомологические ряды гликанов с разной молекулярной массой не позволяют использовать для их обнаружения единую реакцию. Реакции, которые воспроизводятся на лабораторном занятии, подразделяются на:

а) реакции непосредственно на полисахариды;

б) реакции на продукты их гидролиза — восстанавливающие моносахариды и кислоты уроновые.

Качественные реакции

Качественные реакции на полисахариды могут проводиться как непосредственно на сухом сырье, так и с водными извлечениями из сырья.

Реакции, проводимые с водными извлечениями из сырья:

1. Реакция 1 - осаждение этанолом из водного извлечения (листья подорожника большого, слоевища ламинарии, трава череды). 10 г измельченного сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды и нагревают с обратным холодильником на электрической плитке в течение 30 мин, поддерживая слабое кипение. Извлечение процеживают через 5 слоев марли, вложенных в стеклянную воронку диаметром 55 мм. К 10 мл раствора прибавляют 10-30 мл 95% спирта, перемешивают; появляются хлопьевидные сгустки, выпадающие в осадок при стоянии (полисахариды).

2. Реакция с реактивом Фелинга (слоевища ламинарии, трава череды). Раствор с осадком (см. реакцию 1) фильтруют через стеклянный фильтр ПОР-16, осадок с фильтра переносят в пробирку, прибавляют 2 мл разведенной хлористоводородной кислоты, нагревают, затем прибавляют 10 мл реактива Фелинга и снова нагревают; появляется оранжево-красный осадок (восстанавливающие сахара).

3. Реакция с карбазолом (листья подорожника большого). Раствор с осадком (см. реакцию 1) фильтруют через стеклянный фильтр ПОР-16, осадок с фильтра переносят в колбу вместимостью 50 мл раствором натра едкого (0,1 моль/л). К 1 мл полученного раствора прибавляют 0,25 мл 0,5% раствора карбазола и 5 мл концентрированной серной кислоты, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин; появляется красно-фиолетовое окрашивание (галактуроновая кислота).

Гистохимические и микрохимические реакции:

 Обнаружение крахмала под микроскопом. Крахмальные зерна хорошо видны в воде и глицерине. Яркая картина наблюдается в поляризованном свете; в результате двойного лучепреломления крахмальные зерна дают черный крест, полосы которого пересекаются в центре наслоений зерна.

 Реакция с йодом на крахмал. Применяется раствор йода в йодиде калия (раствор Люголя), раствор йода в спирте или в какой-либо просветляющей жидкости. Крахмал, смоченный водой, при нанесении реактива окрашивается в синий или в сине-фиолетовый цвет, сухой - в темно-бурый. Присутствие продуктов частичного гидролиза крахмала - декстринов - обнаруживается по красному или красно-фиолетовому окрашиванию. Реакция является специфической на крахмал. Исследуемый объект (порошок или поперечный срез) помещают в каплю реактива, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. Крахмальные зерна приобретают синее или сине-фиолетовое окрашивание. Следует помнить, что окраска исчезает при нагревании. Приготовленный препарат надо исследовать тотчас, так как окраска держится недолго. Если в объекте крахмала мало, то лучше использовать раствор йода в хлоралгидрате: к готовому раствору хлоралгидрата прибавляют (в избытке) кристаллический йод и взбалтывают. Реактив хранят в темном месте. Хлоралгидрат просветляет объект и вызывает клейстеризацию крахмальных зерен, что улучшает результаты реакции.

 Реакция осаждения инулина спиртом. Инулин обнаруживается в растительном материале, фиксированном в спирте, в виде слоистых сферокристаллов. В горячей воде сферокристаллы инулина растворяются. Кусочки свежего растительного материала помещают на несколько дней в 70% спирт. Приготовленные из него срезы наблюдают в спирте или в глицерине. Инулин имеет форму сферокристаллов, состоящих из тончайших иголочек. При добавлении воды и последующем нагревании кристаллы инулина растворяются.

ÂРеакция Молиша на углеводы. Положительные результаты дают все углеводы: сахара, крахмал, инулин. Реактивы: а) 10-20% спиртовой раствор тимола или α-нафтола; б) концентрированная серная кислота. Срез помещают в раствор тимола (или α-нафтола), прибавляют каплю концентрированной серной кислоты и накрывают покровным стеклом. При наличии углеводов появляется оранжево-красное (тимол) или красно-фиолетовое (α-нафтол) окрашивание. С порошком или соскобом сухого растительного материала реакцию можно проводить на часовом стекле. Результаты реакции хорошо фиксируются невооруженным глазом на белом фоне.

 Реакция с метиленовым синим. Используется спиртовой раствор метиленового синего (1:5000). Срез помещают на несколько минут в реактив, затем переносят в глицерин. Слизь окрашивается в голубой цвет.

 Реакция с сульфатом меди в щелочи. Срез помещают на 5-10 мин в концентрированный раствор сульфата меди, промывают водой и переносят в 50% раствор едкого кали. Слизь окрашивается в синий цвет (растения семейства мальвовых, орхидных) или в зеленый цвет (растения семейства лилейных).

 Реакция «двойного окрашивания». Срез помещают на 20 мин в раствор хлорида окисного железа, затем переносят на 2-3 мин в раствор метиленового синего, промывают водой и заключают в глицерин. Реакция выглядит особенно наглядно с поперечным срезом корня алтея: клетки со слизью окрашиваются в желтый цвет, механические волокна - в голубой, сосуды древесины - в зеленый.

 Реакция с тушью. Тушь (для черчения) разводят водой в соотношении 1:10 (реактив готовят по мере надобности). Порошок исследуемого сырья помещают на предметное стекло в каплю туши, тщательно размешивают и накрывают покровным стеклом. В поле зрения микроскопа на темно-сером (почти черном) фоне наблюдаются белые пятна - клетки со слизью. Тушь окрашивает все ткани, но не проникает в клетки со слизью.

Гидролиз полисахаридов. Полисахариды подвергаются кислотному или ферментативному гидролизу с образованием моно- или олигосахаридов. Образующиеся мономеры дают характерные для них реакции.

Хроматографический анализ. Под воздействием разведенных или концентрированных кислот гликозидные связи частично или полностью разрываются с образованием моно- и олигосахаридов. Методами БХ, ТСХ, ГЖХ устанавливают углеводный состав гидролизата. Физико-химические и хроматографические характеристики олигосахаридов свидетельствуют о строении отдельных фрагментов молекулы полисахарида.

Количественный анализ полисахаридов. Содержание полисахаридов в растительном сырье, как правило, определяют гравиметрическим методом. В препаратах проводят кислотный гидролиз, а далее оптическими методами измеряют плотность окрашенных растворов, которые образуются при взаимодействии восстанавливающих моносахаридов с кислотой пикриновой в щелочной среде. Происходит восстановление нитрогруппы кислоты пикриновой до аминогруппы с образованием кислоты пикраминовой. Соль ее имеет хиноидную структуру, поэтому окрашена в красный цвет.

Реакция взаимодействия восстанавливающих сахаров с кислотой пикриновой:

При подкислении раствора хиноидная структура переходит в фенольную и окраска слабеет.

Биологическая активность. Полисахариды обладают отхаркивающим, слабительным, обволакивающим, сорбирующим, детоксицирующим, противовоспалительным, противоязвенным и другим действием. Растворы декстрана применяют как заменители плазмы крови. Пектиновые вещества (пектин) в присутствии органических кислот и сахаров образуют студни, обладающие противовоспалительным и адсорбирующим действием. Пектин используют при отравлении солями тяжелых металлов и для улучшения пищеварения. Многие полисахариды служат вспомогательными веществами в фармацевтическом производстве (крахмал и его модификации, камеди, пектин, целлюлоза, ее производные и др.), выполняя функции наполнителей, стабилизаторов, эмульгаторов, пленко- и основообразователей.

Полисахариды широко распространены в природе. Растения содержат до 90% полисахаридов и являются основным источником их получения. В растениях полисахариды накапливаются в травах, листьях, семенах и подземных органах.