Задача 3. Влияние рН на активность амилазы слюны

Лабораторная работа №2

Общие свойства ферментов

Вещества, которые изменяют скорость химической реакции, активно участвуют в ней, но сами при этом не расходуются, называются ферментами.

Реакции, протекающие под действием катализаторов, называют каталитическими. Явление изменения скорости химической реакции под влиянием катализаторов называют катализом.

Ферменты или энзимы – биологические катализаторы белковой природы. Основная функция энзимов в организме – каталитическая и регуляторная. К основным свойствам ферментов относят:

1. Все ферменты – вещества белковой природы (сложные и простые);

2. Все ферменты являются термолабильными соединениями, то есть оптимум их действия (температурный оптимум) от 0°С до 45°С (за исключением энзимов термофильных организмов), их действие зависит от значения рН;

3. Ферменты специфичны по отношению к субстрату (S) или группе сходных субстратов;

4. Энзимы обладают высокой каталитической активностью.

Цель работы:ознакомиться с общими свойствами ферментов – специфичностью, термолабильностью, конформационной лабильностью, влиянием активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Задача 1. Действие амилазы слюны на крахмал

Описание работы:

При взаимодействии раствора I₂ с крахмалом образуется адсорбционное соединение сложного состава, имеющее синий цвет. Реакция экзотермическая. Равновесие этой реакции можно условно представить следующей схемой:

I₂ + (С₆Н₁₂О₆)_n ↔ йодокрахмальный комплекс

Под действием амилазы на крахмал происходит разрыв ковалентных гликозидных связей в молекуле полимера. Амилазы относятся к классу ферментов гидролаз. Реакции, катализируемые этими ферментами, идут по общей схеме:

R—R₁ + Н—ОН →  R—Н + R₁—ОН

   гидролиз

R—О—R + Н—ОН  →     R—ОН + R₁—ОН

                        гидролиз

Гидролиз крахмала амилазой протекает через образование ряда промежу­точных продуктов реакции до конечных продуктов - мальтозы и глюкозы. В ходе реакции гидролиза сначала образуется амилодекстрины (фиолетово-синие продукты), затем - эритродекстрины (красно-бурые продукты) и, наконец, ахродекстрины (желто-бурые продукты), а также мальтоза и глюкоза. Промежуточные продукты гидролиза определяются по цвету реакции, кото­рую они дают с йодом. Конечные продукты - мальтоза и глюкоза - имеют сво­бодные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительный процесс. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а ионы меди (CuОН)- голубого цвета, восстанавливаются в гидрат закиси меди желтого цвета. При нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, пипетки, штативы, спиртовка, пробиркодержатели.

0,5% раствор крахмала; 0,1% раствор I₂; 10% раствор NaOH; 7% раствор CuSO₄

Исследуемый материал:

Слюна.

Ход работы:

1. В 5 пробирок налить по 2 мл 0,5% раствора крахмала, согласно схеме, приведенной в таблице 2.

2. Быстро прибавить, начиная от 1-ой к 5-ой пробирке, по 2-3 капли слюны.

3. В 1-ую пробирку сразу внести каплю 0,1% раствора I_2.

4. В остальные пробирки раствор I₂ добавляют с интервалами через 30 секунд. В пробирке, где желтый цвет раствора I ₂ не изменяется, гидролиз считают завершенным.

5. Затем во всех пробирках проводят реакцию Троммера.

6. Пробирку с продуктами реакции подогреть - йод улетучивается.

7. Прибавить по 4-5 капель 10% раствора NaОН и по 5-7 капель 7% раствора CuSO₄.

8.  Содержимое пробирок нагреть до кипения. Выпадает желтый (крас­ный) осадок закиси (окиси) меди, так как глюкоза обладает восстановительны­ми свойствами.

Таблица 2.

Инкубационные смеси

Оформление работы:

Результаты опыта внести в таблицу 3. Сделать выводы о скорости гидролиза крахмала амилазой слюны и о наличии молекул глюкозы в растворах после 30, 60, 90 и 120 секунд инкубации.

Таблица 3.

Активность амилазы слюны

Задача 2. Влияние температуры на активность амилазы слюны

Задача 3. Влияние рН на активность амилазы слюны

Описание работы:

Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с раствором йода. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (отсутствует йод). По мере удаления от оптимума рН в кислую или щелочную зоны расщепление крахмала произойдет только частично, до стадии декстринов, или крахмал вообще не подвергнется расщеплению.

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки, термостат.

0,5% раствор крахмала, 0,1% раствор I₂; 1/15М растворы фосфатного буфера с разными значениями рН (5,5-8,0).

Исследуемый материал:

Слюна.

Ход работы:

1. В 4 пробирки налить по 0,1 мл слюны и добавить по 0,4 мл дистиллированной воды, согласно схеме, приведенной в таблице 6.

2. Во все пробирки добавить по 1 мл 0,5% раствора крахмала.

3. В первую пробирку добавить 0,5 мл фосфатного буфера рН 5,5, во вторую пробирку – 0,5 мл буфера рН 6,5, в третью – 0,5 мл буфера рН 7,0 в четвертую – 0,5 мл буфера рН 8,0.

4. Поместить все пробирки на 10 мин в термостат при 37 °С.

5. После окончания срока инкубации по все пробирки добавить по 1-2 капли 0,1% раствора йода и отметить интенсивность и цвет развившейся окраски.

Таблица 6.

Инкубационные смеси

Оформление работы:

Результаты записать в таблицу 7, сделать вывод о влиянии рН на активность амилазы. Какое значение рН близко к оптимуму для действия амилазы слюны на крахмал?

Таблица 7.

Результаты опыта