Заочної форми навчання                                                  Пеляшенко О.В.

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Навчально-науковий центр

«Інститут біології»

ЩОДЕННИК

ВИРОБНИЧОЇ ПРАКТИКИ

(                                                               2013 рр.)

(терміни практики)

Студентки 4 курсу

Заочної форми навчання кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Пеляшенко Олександри Володимирівни

ЗАВДАННЯ ПРАКТИКИ

1. Дослідити цитотоксичність глютамату натрію у різних концентраціях з використанням мікроядерного тесту на рибах Danio rerio.

2. Проаналізувати на цитотоксичність глютамат натрію у пробах крові, тканини зябер та хвостового плавця риб Danio rerio.

3. Провести біотестування на виживаність з використанням ембріонів риб Danio rerio.

4. Дослідити вплив глютамату натрію на виживаність Hydra attenuate Pallas

5. Проаналізувати біотестування глютамату натрію з використанням ракоподібних Ceriodaphnia affinis lilljeborg.

6. Підготувати звіт і статтю по результатам дослідження

Науковий керівник            _____________________     Верголяс М. Р.

Ст. наук. співр.,

Канд. біол. наук                      

КАЛЕНДАРНИЙ ПЛАН ПРАКТИКИ

ХАРАКТЕРИСТИКА

на студентку 4 курсу заочної форми навчання кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Пеляшенко Олександру Володимирівну

Науковий керівник          

Ст. наук. співр.,

Канд. біол. наук                      _____________________  Верголяс М. Р.

З В І Т

З виробничої практики

У дослідах на різних тест-системах, зокрема риби, ембріони риб, гідра, дафнія проведено вивчення впливу глутамату натрію (Е 621) на перераховані тест-організми. З літературних даних відомо, що при вживанні від 1 г глутамату натрію (Е 621) на добу, виявлена його токсична дія на організм. Виходячи з цього у даній роботі було взято для дослідження концентрації ( Е621): 0,1 г/1 л води., 0,3 г/1 л води., 0,5 г/1 л води., 0,7 г/1 л води., 1 г/1 л води.

Для вивчення цитотоксичності певних речовин обов’язково використовують мікроядерний тест з використанням риб Danio rerio. З цією метою піддають аналізу клітини крові, зябер та хвостового плавця. За добу до експерименту риб відсаджують по 10 особин в окремі ємності, заповнені контрольною водою, для їх адаптації. Під час експерименту піддослідним рибам надрізали тканину хвостового плавця для того, щоб викликати регенерацію, а отже, і мітоз у слабо мітотично активній тканині плавця. Одночасно воду у ємностях заміняли на досліджуваний розчин, контрольним рибам також надрізали хвостовий плавець, а воду заміняли на свіжу контрольну. Відбір проб крові, тканини зябер та хвостового плавця проводили через 4 діб після початку експерименту. Кров відбирали із хвостової вени і потім робили мазки.

          Поряд з цим проводилибіотестування з використанням ембріонів риб Danio rerio. Запліднену ікру розміщували в 7 мм чашках Петрі, що заповнені розчином токсиканту на синтетичній воді. Кожне розведення було протестовано не менше ніж на 10 ембріонах. На кожну ікринку повинно бути 2мл розчину. Окремо ставилася контрольна чашка. Експеримент вважається достовірним, якщо в контролі загинуло не більше 10% ембріонів. Позитивною відповіддю на дію токсиканту вважається більше 10% ефект або загибель ембріонів.

          Параметри за якими визначається ефект або загибель ембріонів описані в стандартній методиці. Ембріони, які досліджуються, постійно спостерігають на протязі 48 годин інкубування при температурі 26 С⁰. На різних стадіях розвитку виділяють декілька ознак, що свідчать про смерть ембріона.

По-перше, це коагуляція яйця - свідчить про повну загибель.

По-друге, не відділення хвоста ембріона на стадії 24 годин в подальшому призводить теж до загибелі ембріона. На стадії 48 годин повинно бути помітне серцебиття, якщо воно відсутнє, то ембріон вважається мертвим. Деякі дослідники звертають увагу також на відсутність пігментації на 48 годинах розвитку, що теж свідчить про недорозвиненість ембріона в результаті дії на нього токсиканту.

Отримані результати зроблено на підставі спостереження за допомогою бінокулярного мікроскопу. Відповідно до чого проводять записи чи фотографують на цифрову вебкамеру з переносом даних на комп’ютер, де можна чітко роздивитися розвиток на різних стадіях.

              При біотестуванні з використанням Hydra attenuate Pallas за добу до початку експерименту гідр для адаптації переносили з культурального середовища в планшетки з контрольною водою. У кожен відділ планшетки поміщали по 6 гідр, при цьому враховували, що для кожної точки фіксації кожної проби буде використано 3 відділи (усього - 18 гідр). Перед початком експерименту, контрольну воду у відділах, призначених для досліджуваних розчинів, відбирали й заміняли експериментальним розчином, виготовленим на контрольній воді, а в контрольних - контрольним.

Для визначення гострої токсичності на гідрі H. attenuata - організми утримували в досліджуваному розчині протягом 96 годин. За змінами морфології тварин, а також їх смертністю робили висновки щодо токсичної дії розчинів.

Разом з тим проводилось біотестування з використанням ракоподібних Ceriodaphnia affinis lilljeborg.Принцип методики біотестування з використанням церіодафній той же, що в методиці з використанням дафній. Основною відмінністю є час біотестування - до 48 годин. Короткочасне біотестування дозволяє визначити гостру токсичну дію води на церіодафній за аналізом їх виживаності.

Показником виживаності служить середня кількість тесту-організмів, що вижили в тестованій воді по відношенню до контролю за певний час. Критерієм гострої токсичності є загибель 50 і більше особин, а також для хронічної токсичності - від 20 до 40 більше відсотків церіодафній за період часу до 48 годин у тестованій воді порівняно з контролем.

Об'єм проби води для біотестування становить 0,5 л. На початку у воді визначають концентрацію розчиненого кисню, яка не має бути менше 5,0 міліграма/л. Якщо цей показник нижчий, то тестовану воду аєрують за допомогою мікрокомпресора. В процесі біотестування вода не аєрується. Біотестування проводять в кліматостаті або боксі, в яких забезпечується оптимальний температурний і світловий режими.

Результати біотестування вважаються достовірними, якщо за весь період спостережень загибель дафній в контролі не перевищувала 10%, а концентрація розчиненого кисню в кінці біотестування складала не менше 2 міліграмів/л.

Для проведення біотестування у 10 ємностей наливають по 15 мл контрольної і тестованої води. У кожну судину за допомогою пластикової піпетки з діаметром 2,0 мм поміщають по 1 молодий церіодафнії. Спочатку їх підсаджують у контрольну, а потім - у тестовану воду.

Облік церіодафній, що вижили, проводять через 1, 6, 24 і 48 годин. Особини вважають такими, що вижили, якщо вони вільно пересуваються в товщі води або спливають з дна стакана не пізніше 15 секунд після легкого похитування. Якщо в будь-який період часу, що враховується, в тестованій воді гине 50 і більше відсотків особин, біотестування припиняють. Протягом 48 годин церіодафній не годують.

На підставі аналізу отриманих результатів зроблено висновок, що починаючи з концентрації Е 621 у дозі 0,1 г/1 л води виявлено аномалії ядер клітин крові, хвоста і зябер. При збільшенні концентрації збільшувалась кількість аномалії ядер, зокрема автори відзначали появу мікроядер та подвійних ядер, аж до загибелі клітин апоптозом [17]. Разом з тим зменшується виживаність тест-організмів, зокрема гідри вже на початкових дозах глутамату натрію реагує загибеллю особин, тоді як церіодафнія гине при концентрації Е 621 у дозі 0,7 г/л.

Підсумовуючи вище зазначене можна стверджувати, що вивчення механізму впливу глутамату та його солей на функціонування клітин та елементів тканин, і у цілому організмі, має суттєве практичне значення для клінічної медицині та теоретичне значення для біології.

Студентка 4 курсу

заочної форми навчання                                                  Пеляшенко О.В.