Совершенствование ИФА для диагностики  болезней животных

В настоящее время в совершенствовании серологической диагностики заразных болезней широко используются методы, основанные на использовании ИФА. Это и понятно: ИФА является высокочувствительным тестом, позволяющим за короткое время исследовать большое количество образцов сыворотки крови. Однако высокая чувствительность теста, в первую очередь, требует применения в нем антигена, специфичного для возбудителя. Иначе, высокая чувствительность ИФА идет во вред его диагностической ценности, показывая ложноположительные результаты вследствие наличия у возбудителя и некоторых микроорганизмов общих антигенных детерминант.

Бруцеллез животных остается одной из главных проблем ветеринарии Казахстана. В ИФА-наборах, используемых в последнее время для серологической диагностики инфекции, в качестве антигена выступают липополисахариды (ЛПС) молекулы бруцелл. Известно, что ЛПС Brucella  практически единтичны аналогичному антигену, полученному из Yersinia enterocolitica 0:9, и имеют гомологичные эпитопы с многими грамотрицательными микроорганизмами на которые в организме животных имеются антитела. Кроме того, иммунной системе вакцинированного организма более доступны ЛПС, расположенные поверхностно, и поэтому антитела в основном вырабатываются на детерминанты полисахаридной молекулы. В этой связи, нет сомнений в том, что использование данного антигена в ИФА приводит к необоснованному убою определенного поголовья здоровых животных, выработавших антитела в результате иммунизирующей субинфекции или вакцинации.

В НИИ биотехнологии КазАТУ им. С.Сейфуллина (А.К.Булашев и соавт.) проведена работа по определению диагностической ценности белков внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19. Выбор данного антигена основан на следующих положениях. Во-первых, грамотрицательные микроорганизмы, хотя и имеют большие сходства между собой по ЛПС, существенно различаются по антигенам БВМ. Во-вторых, в иммунизированном организме вакцинные штаммы задерживаются, как правило, в течение короткого времени (1-3 мес.). Поэтому для иммунной системы вакцинированных животных более доступны ЛПС, расположенные на поверхности клетки, чем белковые антигены «замаскированные» сложным комплексом поверхностной структуры. В этой связи привитый организм успевает вырабатывать антитела в основном на ЛПС. В организме инфицированного животного происходит длительная персистенция бруцелл, сопровождающаяся реакцией иммунной системы на возбудителя болезни, пытающегося локализоваться в излюбленных им органах. Это приводит к накоплению в тканях большого количества продуктов распада бруцелл, среди которых имеются и БВМ, которые ранее были не доступными для иммунной системы.

Тест-система ИФА для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, разработанная сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина, основана на использовании БВМ бруцелл. Как показали результаты исследований, тест оказался более специфичным, нежели общеизвестные серологические реакций. Постановка ИФА проводилась в двух вариантах. В непрямом ИФА БВМ были иммобилизированы к твердой фазе неспецифически, а в «сэндвич» варианте – посредством моноклональных антител (МКА), имеющих специфичность к эпитопу белка с молекулярной массой 50 кД. Сравнивая диагностическую значимость двух методов постановки ИФА, исследователи предпочтение отдают «сэндвич» варианту. Во-первых, в последнем случае белковый антиген, в составе которого имеется эпитоп моноклональных антител, фиксируется к твердой фазе специфически. При этом другие белковые компоненты БВМ бруцелл удаляются в процессе отмывки лунки планшеты. Таким образом, в ходе постановки «сэндвич» ИФА первые антитела осуществляют отбор антигенов, свойственных для бруцелл из состава БВМ бруцелл. Это, безусловно, повышает специфичность данного теста. Разработчик имеет научно-техническую документацию и опытные образцы иммуноферментного диагностикума (зарегистрирован в Государственном реестре ветеринарных препаратов за №РК-ВП-2-0126-04 от 27.01.2004.). Авторские права защищены патентом РК №14230 «Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза» (Бюл.№4, опубл.15.04.2008.). Высокая специфичность белковых антигенов Leptospira, серогруппы Hebdomadis   была отмечена нами при серологической ИФА-диагностике крупного рогатого скота на лептоспироз в сравнении с другими иммунологическими методами. (А.К.Булашев, 2005). Диагностикум существенно превосходил по чувствительности и специфичности реакцию микроагглютинации и лизиса (РМАЛ) и на 6% больше выявлял серопозитивных животных, чем его зарубежный аналог «IФА-лептоспiроз-ВРХ» (М.А.Куйбагаров, 2006).В литературе имеются сообщения о перспективности использования БВМ в диагностике других инфекционных болезней. Например, на основе БВМ Yersinia pseudotuberculosis сконструирован псевдотуберкулезный видоспецифический антигенный полимерный диагностикум для объемной реакции агглютинации. При этом чувствительность диагностикума составлял 100%, специфичность – 85,7-89,5% (Д.И.Симакова и др., 2011). 

Большую практическую значимость имеют и методы детекции антигенов возбудителей инфекционных болезней, предложенные учеными КазАТУ им.С.Сейфуллина. Так, диагностический набор, основой которого являются МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА, позволяет обнаруживать Brucella abortus  в патматериале, а именно в паренхиматозных органах и лимфатических узлах, а также в содержимом желудка аборт-плодов (А.К.Булашев, 1992). МКА упомянутых штаммов были использованы Н.А.Бызовой и соавт. (2011) для разработки экспрессных иммунохроматографических тестов (ИХТ) для детекции антигенов Brucella abortus и антител против данного патогена. Тесты для определения антигена Brucella abortus позволяют в течение 10-15 мин выявлять в биоматериале ЛПС в концентрациях до 5 нг/мл., единый стандартный бруцеллезный антиген до 1 млн.кл/мл. Результаты серологический исследований с помощью ИХТ полностью совпали с данными ИФА.    

Экспресс-тест на основе МКА был апробирован нами и для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале. Установлено, что «dot» ИФА с использованием антител к Mycobacterium bovis как в «сэндвич», так и в прямом варианте по чувствительности и специфичности, и, естественно, по времени проведения (3,5-4 часа) существенно превосходит классические методы исследований (микроскопический, бактериологический) и сопоставим с ПЦР-диагностикой. Данный тест, в отличие от других использованных, давал возможность дифференцировать Mycobacterium bovis от других видов, включая представителей атипичных микобактерий (А.К.Булашев и соавт., 2010; 2011). Заслуживает внимания и иммуноферментный диагностикум, предназначенный для серологического обследования крупного рогатого скота на туберкулез (A.K.Bulashev, 2003). По результатам апробации у всех животных, показавших позитивные результаты одновременно по ИФА и аллергической пробе, в легких и лимфатических узлах выявлены поражения, характерные для туберкулеза, тогда как у коров, реагировавших только на ППД-туберкулин, видимые изменения во внутренних органах не обнаруживались.  

В связи с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, ящуру и бешенства ветеринарная служба Казахстана нуждается в эффективных экспресс-тестах для мониторинга санитарного состояния объектов внешней среды. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина и Национального центра биотехнологии РК (НЦБ РК) разработан высокоспецифичный метод индикации возбудителя B.anthracis в почве, основанный на использовании двух видов МКА в «dot» ИФА на нитроцеллюлозной бумаге (А.К.Булашев и соавт., 2005). Чувствительность теста составляла 4 500 м.кл./мл. Кроме того, его можно использовать для обнаружения сибиреязвенных бацилл и в других объектах внешней среды (вода, корма), а также в сырье животного происхождения.

Учеными двух названных научных учреждений были созданы 3 штамма-продуцента МКА к вирусу ящура и 4 гибридомы, синтезирующие антитела к вирусу бешенства и предложены методы ИФА для лабораторной диагностики упомянутых вирусных болезней (А.К.Булашев и соавт., 2005). Тест-система для идентификации антигенов вируса бешенства методом ИФА разработана и НИИ проблем биологической безопасности РК (Е.С.Жилин и соавт.,2011) . В результате проведенных исследований в 13 из 15 исследованных полевых материалах (мозг и слюна), отобранных от коров, овец, лис и корсаков, имеющих клинические признаки заболевания бешенством, выявлен антиген вируса бешенства. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб полевых материалов с использованием коммерческого ИФА-набора для диагностики бешенства (Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Казань). НЦБ РК и НИИ Физико-химической медицины (г.Москва) получен штамм-продуцент E.coli рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. ИФА на основе упомянутого антигена, обладая высокой специфичностью, выявляла антитела в сыворотке крови больных коров в разведении 1:320 (К.Н.Мукантаев и соавт., 2011).

Одним из многообещающих подходов повышения специфичности ИФА является использование в этом тесте антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. «внутренних образов» исходного антигена. При этом, однажды полученные моноклональные антитела к специфичному эпитопу определенного возбудителя могут быть использованы для получения моноклональных АИАТ, которые в последующем заменят исходный антиген и исключают тем самым необходимость работы персонала патогенными микроорганизмами. АИАТ способны имитировать любые, в том числе слабоиммуногенные и слабоантигенные детерминанты гаптенов, полисахаридов, липидов, зачастую выделяемых в деградированной форме и, следовательно, лишенных части эпитопов, присущих нативной молекуле, или же сохраняющих высокую токсичность за счет особенностей экстракции. АИАТ, выступающие в роли белкового «заменителя» определенного бактериального антигена, позволяют устранять подобные препятствия и эффективно презентировать атоксичные детерминанты клеткам иммунной системы. Именно поэтому АИАТ в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве «суррогата» антигена или его отдельных детерминант для индукции протективного иммунного ответа против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов – возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Бесспорным преимуществом подобного подхода является отсутствие необходимости предварительного выделения изучаемой субстанции. Абсолютная специфичность МКА, использованных для получения АИАТ, предопределяет их гомологию исходному антигену.   

Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина были получены АИАТ к идиотипу Ат2-бета моноклональных антител, направленных на поли-Б антиген бруцелл (С.Г.Оспанова и соавт, 2009). Одним из критериев характеристики АИАТ как Ат2-бета по сообщениям ряда авторов, является способность их взаимодействовать с ксеногенными антисыворотками, специфичными к исходному антигену, так как только этот идиотип, несущий «внутренний образ» антигена, могут связывать специфические антитела. Поэтому изучалось взаимодействие моноклональных АИАТ с кроличьей поликлональной моноспецифической антисывороткой и поликлональной позитивной сывороткой крупного рогатого скота в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом, проявляли активность по отношению к указанным ксеногенным сывороткам в титрах от 1:1600-1:3200. Одним из значимых свойств Ат2-бета является их способность индуцировать синтез гомологичных антител третьего порядка (анти-АИАТ), направленных против исходного антигена. Для этой цели были проведены серии иммунизаций линейных мышей препаратами АИАТ. Сыворотки мышей исследовали в непрямом ИФА на наличие антител третьего порядка, способных взаимодействовать с исходным поли-Б антигеном бруцелл. Как показали результаты, полученные АИАТ при введении в организм животных способны стимулировать синтез антител третьего порядка (Ат3), направленных против исходного антигена. Таким образом, исследователями доказана возможность применения АИАТ в качестве антигена при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в ИФА.

Феномен антиидиотипии в диагностике кровепаразитарных болезней (пироплазмозов, анаплазмозов, нутталиозов, трипаносомозов) изучалась и Г.С. Шабдарбаевой и соавт. (2009). Ими установлено, что АИАТ к антигенам различных кровепаразитов, полученные в результате двукратной иммунизации лабораторных животных – кроликов, достаточно информативны, специфичны и их вполне можно использовать в качестве диагностикумов в таких серологических тестах, как РНГА и ИФА.

Иммуноферментный анализ с использованием F(ab)2-фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов был предложен Б.Б. Гнеденко и соавт. (2006). Ими проведено определение сывороточного содержания аутоантител к трем группам белков в норме и у пациентов с шизофренией с помощью стандартных методов и тест-систем с иммобилизованными F(ab)2-фрагментами АИАТ. Уровни аутоантител ко всем белкам у пациентов с шизофренией были выше, чем в группе контроля.

Е.С.Жилин и соавт. (2011) испытали поликлональные антиидиотипические иммуноглобулины и их конъюгаты с пероксидазой хрена в ИФА для выявления антирабических антител в сыворотках животных. В результате испытаний регистрировали положительные результаты со специфическими сыворотками в независимости от вида продуцентов антирабических антител при отрицательных результатах с нормальными и гетерологичными сыворотками. Чувствительность тест-системы в 2-4 раза превышала непрямой и конкурентный вариант ИФА. 

Представляют большой интерес работы, посвященные проблемам адаптации ИФА тестов условиям практики за счет удлинения срока годности иммуноферментного конъюгата. При этом изучается возможность использования иммобилизованных ферментов, искусственно связанных с нерастворимым носителем и при этом сохраняющих свои свойства. Иммобилизованные ферменты в тысячи раз стабильнее свободных. Все это обеспечивает высокую экономичность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные препараты. Одним из существенных факторов, сдерживающих широкое использование ИФА на производстве, является непродолжительный срок годности иммуноферментного конъюгата (6-12 мес. при надлежащем хранении в холодильнике). А.С.Геогджаян и соавт. (2011) получили иммобилизованные ферменты и применили их в разработке диагностических тест-систем для выявления возбудителей инфекционных болезней. Технология получения иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активация пероксидазы хрена; включение фермента в липосомы (или иммобилизация на алюмосиликате); иммобилизация полученных препаратов с иммуноглобулинами; очистка от не связавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. В качестве носителя необходимо было выбрать такой, который бы не препятствовал проникновению к нему субстрата и не лишал фермент подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции. Иммобилизованный в липосомах материал оказывается защищенным липидной мембраной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности. Исследователями определены оптимальные условия получения высокостабильных и специфичных иммобилизованных иммунопероксидазных конъюгатов при использовании в качестве носителей липосом и алюмосиликата. Показана перспективность иммобилизации носителей с ферментом и иммуноглобулинами. Иммунопероксидазные конъюгаты апробированы при ИФА на гомо- и гетерологичных штаммах возбудителей туляремии и лептоспироза. Срок годности разработанных препаратов увеличивается до 5 лет для липосомных и до 3 лет для алюмосиликатных иммунопероксидазных конъюгатов без снижения чувствительности и специфичности.

Заслуживают внимания практиков и методы диагностики инфекционных болезней, основанные на иммунохроматографии. Так, Н.А.Бызовой и соавт. (2010) предложена иммунохроматографическая детекция клеток Mycobacterium tuberculosis. Разработаны конкурентный и «сэндвич» варианты иммунохроматографического анализа, в которых контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами непосредственно инициируют движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимическое взаимодействие и формирование визуально детектируемых окрашенных зон. Показано, что и конкурентный, и «сэндвич» варианты метода позволяют определять клетки возбудителя туберкулеза в концентрации до 10 тыс. кл./мл (50-100 кл. в пробе). Преимуществом «сэндвич» анализа является возможность качественной визуальной диагностики, когда окрашивание аналитической зоны независимо от его интенсивности свидетельствует о положительном результате анализа.

Жердев и соавт. (2010) разработали иммунохроматографический способ определения антител к возбудителю туберкулеза. Для детекции антител используют два антигенных реагента – иммобилизованный в аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis  и конъюгата антигена возбудителя с частицами коллоидного золота. Комплексы определяют визуально или с использованием оптического детектора.

ИФА, особенно его точечный («dot») вариант, достаточно широко используют в диагностике таких паразитарных заболеваний, как амебиозы, бабезиозы, фасциолезы, лейшманиозы, гиподерматоз, эхинококкоз и токсоплазмоз. Эта реакция имеет очевидные преимущества перед другими иммуноферментными тестами, прежде всего, в возможности проведения большого числа анализов при значительно меньших объемах исследуемого образца, расходуемых реактивов, материалов и иммунореагентов. Антитела или антигены в иммунодоте наносятся в минимальных количествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью на единицу площади, чем носители с гладкой поверхностью, используемых в панельных тестах. С другой стороны, при проведении иммунодота можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно в период массовых исследований в полевых условиях. В.Г.Бережко и соавт. (2009) испытали точечный ИФА в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза свиней. Специфичность иммунодота при первой инвазии составила 97,4%. Наибольшее количество ложноположительных ответов регистрировали у свиней с естественной инвазией E.granulosis . По мнению авторов, с одной стороны, такой результат можно объяснить наличием общих для трихинелл и эхинококков белковых эпитопов, а с другой – он мог быть спровоцирован различными заболеваниями печени, при которых ложноположительные ответы наблюдают на антигены самых различных возбудителей. Специфичность иммунодота при эхинококкозе составила 68%. Основная причина ложноположительных результатов с сыворотками крови свиней, инвазированных C.tenuicollis , - близкое антигенное родство этого паразита с E.granulosis доказано иммунохимическим методом. 

В течение последних трех лет (2009-2011 гг) НИР ученых-биотехнологов нашего университета была направлена на совершенствование методов диагностики заразных болезней животных, таких как лейкоз, эхинококкоз и описторхоз. Выбор названных болезней является неслучайным. Анализ эпизоотической ситуации показывает, что лейкоз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах с высокоразвитым молочным животноводством. Инфекция наносит большой урон селекции и племенной работе, сокращает сроки эксплуатации животных, снижает молочную продуктивность, качества молока и мяса. По данным ветеринарной отчетности племенных хозяйствах Казахстана доля скота, положительно реагирующего на лейкоз доходит в среднем до 6%. Оздоровительные мероприятия основаны на своевременном выявлении и изоляции из стада инфицированных животных. Однако РИД и ИФА, наиболее чаще используемые для этой цели, не всегда дают объективные результаты. Первый тест имеет низкую специфичность, а второй из-за своей высокой чувствительности могут давать ложноположительные реакции в случае использования недостаточно очищенного антигена вируса.

В этой связи перед нами была поставлена задача разработать тест-систему ИФА, позволяющей по ходу анализа избавляться от нежелательных компонентов вируссодержащего материала, и тем самым способствующей сенсибилизации твердой фазы антигенами, специфичными для возбудителя лейкоза. С целью придания тест-системе такого селективного свойства, т.е. свойства отделять специфичный антиген от балластных веществ, были испытаны МКА - один из популярных на сегодняшний «инструментов» иммунологов.

 Продуцентами МКА явились штаммы культивируемых клеток мышей, полученные нами методом гибридомной техники. Создание штаммов-продуцентов с желаемыми свойствами - дело не из легких, но, как показывает мировая практика, однажды полученные штаммы, позволяют с лихвой окупить все расходы, предоставляя исследователям весьма ценные препараты - однородные антитела со строгой специфичностью.        

Иммунизацию линейных мышей проводили гликопротеидным gp51 и полипептидным p24 антигенами вируса лейкоза. В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками получены 3 штамма гибридных клеток, синтезирующих МКА к полипептидному антигену и 6 штамма гибридом, продуцирующие антитела к гликопротеидному антигену вируса.МКА, полученные в результате культивирования штамма-продуцента в брюшной полости сингенных мышей, характеризовались высокой активностью и аффинностью по отношению к исходным антигенам.  В наших исследованиях МКА были испытаны в качестве лиганды для фиксации вирусспецифического антигена к твердой фазе при постановке «сэндвич» ИФА.

 Лунки планшет сначала сенсибилизировали МКА, пассировали активные центры полистирола, затем вносили вируссодержащий материал. При этом антитела избирательно связывались с теми антигенами, которые в своем составе имели специфичные для них эпитопы. Отмыв лунки планшет от не связавшихся компонентов, вносили образцы сыворотки крови или молока коров. При наличии в исследуемых пробах противовирусных антител, последние связываются с другими эпитопами антигена, фиксированного к твердой фазе посредством антител, образуя иммунный комплекс. Этот комплекс выявляли с помощью антибычьего конъюгата. В результате многочисленных опытов нами были определены оптимальные параметры и условия постановки ИФА для диагностики лейкоза.

По своей диагностической ценности наш метод не уступал коммерческим ИФА тест-системам. Итоги исследований легли в основу лабораторного регламента изготовления и применения компонентов диагностического набора. Метод скрининга поголовья крупного рогатого скота на маркеры вируса лейкоза на основе выявления интегрированного генома возбудителя в крови был разработан сотрудниками НЦБ РК (Е.Б.Евтыхова и соавт., 2011). Образцы выделенной из крови ДНК были протестированы на наличие провируса методом мультиплексной ПЦР с использованием смеси праймеров нацеленных на ген env и на фрагмент гена актина (внутренний контроль амплификации). Детекцию амплификаторов осуществляли электрофорезом в 2%-геле агарозы. Учеными этой же научной организации (К.К.Муканов и соавт., 2011) разработана ИФА на основе рекомбинантного р24 антигена вируса для серологической диагностики лейкоза.

Среди паразитарных болезней животных наибольшую тревогу вызывает эхинококкоз, так как эта болезнь наносит не только экономический, но и социальный ущерб. Люди заражаются при непосредственном контакте с собаками – пораженными половозрелыми эхинококками Echinococcus granulosis, а также при поедании овощей и плодов, загрязненных яйцами гельминта. При этой инвазиив печени, реже в легких и других органах промежуточных хозяев (с.х.животные и человек) образуются множественные кистозные образования, содержащие личинки паразита.  Лечение больных животных не разработано. В редких случаях отмечается самовыздоровление животных с образованием обызвествленных эхинококковых пузырков. По клинической картине диагностировать болезнь весьма трудно. Иногда используют серологические реакций, основанные на обнаружении антител в сыворотке крови животных, такие как реакция сколекспреципитация, непрямая гемагглютинация, РДСК, а также аллергический метод. Однако, ни один из них не нашел применения в ветеринарной практике в силу низкой специфичности. Это и понятно – в этих тестах используется сложнейшая смесь антигенов гельминта. Одним словом, для искоренения болезни нужны достоверные методы диагностики, позволяющие своевременно выявлять и выбраковывать больных животных с последующей утилизацией зараженных органов под контролем ветеринарных специалистов.

 В своей работе мы использовали четыре вида антигена: содержимое эхинококкового пузыря, протосколексы (продукт герминативной оболочки, свободно плавающий в полости капсулы), стенка пузыря и экскреторно-секреторный антиген (ЭС-АГ), выделяемый протосколексами в питательную среду в результате моделирования инвазии in vitro. Все антигены в РИД и ИФА активно взаимодействовали с антителами сывороток крови, полученных от животных с эхинококкозными поражениями. Для дальнейшей работы мы отобрали ЭС-АГ по следующим соображениям. Во-первых, белковый состав продукта жизнедеятельности эхинококка, культивируемого в искусственной питательной среде, намного проще, чем у других видов антигенов, во-вторых, методику получения антигена в условиях in vitro можно стандартизировать, и, в третьих, в случае выздоровления животных с образованием обызвествленных пузырков, естественно, прекращается иммунный ответ организма на метаболиты паразита. 

Протосколексы были получены из эхинококковых пузырей животных во время убоя. ЭС-АГ гельминта выделяли в результате культивирования протосколексов в жидкой питательной среде. Антиген состоял из 11 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-63 кД. Методом гибридомной техники были получены штаммы клеток, продуцирующие антитела к детерминанте экскреторного белка с молекулярной массой 21 кД, и изучены их свойства.

 Принцип обнаружения сывороточных антител, специфичных к эхинококкам, был основан на применении МКА в качестве первых антител в «сэндвич» ИФА. Эти антитела избирательно взаимодействуя с ЭС-АГ способствовали сенсибилизации твердой фазы метаболитами гельминта. Как показали результаты производственного испытания, во всех случаях обнаружения паталогоанатомических изменений, характерных для эхинококкоза, выявлялись и специфические антитела в образцах сыворотки крови.

     Результатылабораторного и производственного испытания были использованы в разработке нормативно-технической документации на диагностическую тест-систему. Опытная партия диагностикума передана в МСХ для регистрации в государственном реестре ветеринарных препаратов.

ИФА, основанный на использовании в качестве антигенов - продуктов жизнедеятельности гельминта, был испытан нами для иммунодиагностики и другой инвазионной болезни - описторхоза - широко распространенного природно-очагового паразитарного заболевания человека, вызываемое гельминтом Opisthorchis felineus.

  Гельминт локализируется в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе. Заражение человека и плотоядных животных - окончательных хозяев данного паразита, происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками гельминта рыб семейства карповых. Болезнь протекает хронически, без выраженных клинических признаков, не всегда в образцах фекалия пациентов, больных описторхозом, обнаруживаются яйца гельминта. Предложен аллергический метод, который, как и другие тесты, основанные на повышенной чувствительности замедленного типа, часто дает фальшрезультаты.

Для извлечения ЭС-АГ описторхиса сначала выделяли метацеркарий из поверхностных и глубоких спинных мышц рыб, обитающих в водоемах бассейна озера Тенгиз и реки Иртыш. Надо отметить, что степень зараженности рыб была довольно высокой, и у отдельных видов она достигала 26%. Затем заражали лабораторных животных (собак, кроликов и хомяков) метацеркариями. По истечении 60 суток животных забивали, изолировали половозрелые гельминтыи культивировали их  в неполной среде Игла для накопления метаболитов.

Методом гибридомной техники получены два штамма-продуцента, МКА которых показали высокую активность по отношению к исходному антигену.

При разработке метода ИФА-диагностики описторхоза нами определялась возможность использования МКАкакв качествеагента,фиксирующего антиген описторхиса к твердой фазе, так и в роли антител, вступающих в реакцию с циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК) сыворотки крови, состоящими из молекул специфического иммуноглобулина и антигена. По данным литературы, на поздних стадиях болезни антитела, активные центры которых заняты антигенами паразита, не выявляются в серологических реакциях. Такие иммунные комплексы могут быть определены другими антителами, специфичными к свободным эпитопам антигена.   

    Предлагаемые тест-системы апробировались на образцах сыворотки крови людей, заведомо больных описторхозом в сравнении с коммерческой тест-системой Описторх-IgG-ИФА АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оба варианта ИФА дали вполне сопоставимые результаты как между собой, так и со сравниваемым аналогом.

Экспертиза продуктов животного происхождения на наличие в них остаточного количества антибиотиков или других биологически активных веществ становится одной из важных задач практической ветеринарии в связи с вхождением Казахстана в Таможенный союз и предстоящим вступлением его в ВТО. Присутствие контаминантов вызывают у людей аллергические реакции, дисбактериоз и другие патологии. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд методов. Наиболее широкое применение нашел микробиологический метод. Несмотря на относительную надежность, метод имеет ряд существенных недостатков. К ним относят низкий уровень чувствительности и воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в лаборатории штаммов тест-микробов. В странах ЕС, США и Японии иммуноферментный анализ является рекомендованным методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения.

Получение антител к антибиотикам является трудновыполнимой задачей, поскольку по своей химической природе они являются гаптенами и не вызывают иммунный ответ. В этой связи в наших исследованиях антибиотики сшивались с высокомолекулярными носителями (БСА, овальбумин). Эти конъюгаты и служили антигеном в гибридомной технике. Осуществив семь слияний иммунных спленоцитов с миеломной линией клеток, нам удалось получить  3 штамма–продуцента антител к гидроксильной группе молекулы стрептомицина, и по 2 штамма, синтезирующие иммуноглобулины к антигенным детерминантам хлорамфеникола (левомицетина) и  окситетрациклина.

Метод, предлагаемый нами дляопределенияостаточного количестваантибиотиков, основан на конкуренции свободного антибиотика, содержащегося в исследуемой пробе и антибиотика, иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за активные центры антител. Диагностическая ценность тест-системы для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции апробирована на пробах молока и мяса в сравнении с коммерческими аналогами.Результаты испытания свидетельствуют о возможности использования ее для экспресс-обнаружения антибиотиков в продуктах питания. Таким образом, ИФА имеет все основания для того, чтобы занять свою достойную нишу в лабораторной практике ветеринарии.

Контрольные вопросы:1. Расскажите об основных результатах научной работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина в области совершенствования диагностики инфекционных болезней животных; 2. Основные итоги работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина по совершенствованию методов диагностики инвазионных болезней; 3. Чем объясняется перспективность применения антиидиотипических антител в иммунодиагностике инфекционных болезней?

Лекция № 4

Биотехнология вакцин

В медицине и ветеринарии широко применяются разнообразные вакцины против инфекционных болезней человека и животных. К сожалению, ряд вакцин слабоиммуногенны, либо имеют побочные эффекты, либо требуют больших производственных расходов.

Рекомбинантные бактериальные вакцины. Иммуногенные свойства патогенных микроорганизмов чаще определяются конкретным белком или полисахаридной молекулой возбудителя, который кодируется одним-единственным геном. В настоящее время достижения генной инженерии дают исследователям возможность заставить прокариотную или эукариотную клетку синтезировать определенный антиген патогена, который будет служить основой для создания генно-инженерной вакцины.

 Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в структуру ослабленных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток высших организмов встраивается ген, который отвечает за образование антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. При этом отпадает необходимость в использовании убитых или ослабленных бактерий и вирусов, обеспечивается безопасность работников предприятий по производству вакцин, отсутствует токсичный или инфекционный материал, который часто загрязняет микробный антиген, полученный из клеточных культур, улучшается экологическая обстановка. Основным объектом приложения для генно-инженерных работ стали противовирусные вакцины, что объясняется простотой организации вирусных геномов. Более сложное строение бактериальных клеток и сравнительно низкая стоимость противобактериозных вакцин являются факторами, сдерживающими развитие генно-инженерных работ. В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены не только гены, контролирующие синтез антигенов возбудителя, но и гены, кодирующие различные медиаторы (белки) иммунного ответа (интерфероны, интерлейкины и др.).

Первым среди возбудителей бактериальных инфекций человека внимание исследователей, занимающихся созданием генно-инженерных вакцин, привлек Treponema pallidum - возбудитель сифилиса. И это неслучайно. Во-первых, несмотря на то, что в распоряжении современной медицины имеются эффективные методы диагностики и терапии, сифилис приобрел эпидемическое распространение как в развитых, так и развивающихся странах; во-вторых, получение чистых культур бледной трепонемы представляет большие трудности, так как она не растет в искусственной среде; в-третьих, невозможно получить вакцину против него с помощью общепринятых методов, основанных на экстракции и очистке антигенов. Ловетт с коллегами (Университет шт. Калифорния) в 1982 году, используя бактериофаг в качестве вектора, ДНК этой спирохеты клонировали в клетках кишечной палочки. Генетический материал для эксперимента был выделен из яичек специально зараженных кроликов. Они получили штамм E.coli, который содержал не менее семи специфических антигенов трепонемы. Эти исследования имели своей целью разработку более специфичных тестов для диагностики сифилиса и производства эффективной вакцины (цит. по А.Сассон, 1987).

В ветеринарии первой генно-инженерной противобактерийной вакциной, нашедшей применение на практике, является вакцина против колибактериозов (эшерихиозов) поросят и телят, вызываемых патогенными штаммами E.coli. Разработчик этой вакцины - голландская ветеринарная фармацевтическая компания “Intervet international”. С целью выделения белка в количествах, достаточных для получения вакцины, они клонировали ген, ответственный за синтез адгезивных антигенов кишечной палочки К88 и К99, в штамме E. coli К-12. Эти антигены в комбинации с адъювантом были использованы для получения вакцины. Иммунизация коров и свиней этой вакциной вызывала образование защитных антител, которые затем передавались новорожденным с молозивом и молоком. Аналогичные вакцины были разработаны и компанией “Цетус” совместно с “Норден лэборатриз” (США) и “Тек Америка груп”.

Для конструирования живых генноинженерных (рекомбинантных) вакцин необходимы три составляющие их компонентов: бактериальный вектор - носитель гетерологических протективных антигенов, гены синтеза гетерологического антигена и генетические структуры, обеспечивающие стабильную и контролируемую экспрессию протективных антигенов, способных в свою очередь индуцировать эффективную защиту иммунизированного организма. 

В качестве бактериальных векторов находят применение сальмонеллы, эшерихии, микобактерии, бациллы, листерии, йерсинии, коринебактерии лактобактерии и франциселлы. При создании рекомбинантных вакцин для ветеринарной медицины наиболее приемлемыми на сегодня являются вакцинные штаммы S.typhimurium, S.choleraesuis, S.dublin, S. еnteritidis, S. аbortusovis, Mycobacterium bovis (шт.BCG), Bac.subtilis, Francisella tularensis (Э.А.Светоч и соавт., 2000). Большинство исследователей в качестве бактериального вектора используют генетически охарактеризованные штаммы сальмонелл, выдвигая в пользу этого следующие аргументы: сальмонеллы могут применяться как перорально, так и парентерально, стимулируя местный и системный иммунитет, включая выработку сывороточных антител и секреторных антител слизистых, клеточно- опосредованный иммунитет и антителозависимую цитотоксичность.

В ГНПЦПМ (Россия) активно разрабатываются проблемы по изучению возможности использования в качестве бактериальных векторов вакцинных штаммов Bac.anthracis. Это обусловлено в первую очередь следующими причинами: показана принципиальная возможность секреции чужеродных белков клетками вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, неприхотливость бациллы к питательным средам и, наконец, высокая устойчивость спор Bac.anthracis, что обеспечит повышенную сохраняемость и стабильность конечных форм вакцинных препаратов.

К антигенам, обеспечивающим полноценную защиту, могут быть отнесены, например, антигены адгезии и термолабильный энтеротоксин патогенных эшерихий, О- и Vi-антигены сальмонелл, холерный и дифтерийный токсины, токсины возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены, злокачественного отека, капсульные антигены чумного микроба и др. Особенно актуальной для ветеринарии является разработка комбинированной вакцины против сибирской язвы и бруцеллеза (Шумилов К.В.). Получена генетическая конструкция, в которой функционируют ген летального токсина сибиреязвенного микроба и ген поверхностного белка Brucella abortus с мол. массой 31 кД (А.П Померанцев). В РосНИПЧИ «Микроб» были сконструированы генно-инженерные штаммы с клонированным геном pag, кодирующим синтез протективного антигена – основного иммуногена возбудителя сибирской язвы.

 Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют и «субъединичными». Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

В ветеринарной науке определенные успехи достигнуты в разработке субъединичной вакцины против ящура. Для защиты от этой инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.

Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl-ген.

Геном вируса ящура представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E.coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой p^L-промотор—cl-peпpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок вируса ящура, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих вирус антител. Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний.

В последнее время интенсивно изучаются белки теплового шока Mycobacterium tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины. С помощью ИФА и моноклональных антител к HSP65 определено наличие белков теплового шока  Mycobacterium tuberculosis в сыворотках крови у больных с подтвержденным туберкулезом и в сыворотках крови у пациентов с подозрением на туберкулез (И.А.Баснакьян и соавт, 2010). HSP65 Mycobacterium tuberculosis обнаруживали в цереброспинальной жидкости у больных туберкулезным менингитом, и наличие этого антигена может считаться диагностическим маркером туберкулезного менингита. Проведены исследования наличия сывороточных антител к HSP70 , HSP65 и  HSP 16 Mycobacterium tuberculosis  при туберкулезе и саркоидозе. При этом обнаружен значительно более высокий уровень указанных антител в сыворотках крови у пациентов с туберкулезом и саркоидозом, чем в сыворотках крови у здоровых людей. Таким образом, доказана важная роль белков теплового шока  в стимуляции иммунитета. О.А.Шараповой и соавт.(2009) были отработаны методы получения рекомбинантного белка теплового шока HSP70M Mycobacterium tuberculosis, изучены его параметры и проведен анализ HSP70M на соответствие требованиям доклинических испытаний. Шевчик Ю.С. и соавт.(2009) установлено, что рекомбинантный HSP70M Mycobacterium tuberculosis усиливает активацию врожденного и адаптивного иммунитета при совместном введении с бактериальными антигенами в эксперименте.

В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis. Из жидкой бактериальной культуры были выделены и очищены шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовались для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis, что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека.

Синтетические пептидные вакцины. Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Идея использования синтетических пептидов в качестве вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механизмов развития иммунитета. В 1974 г. М.Села впервые описал искусственно полученный пептид, вызывающий образование антител к белку лизоцима. Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные естественным антигенам, например, сальмонеллезным полисахаридам.

Техника рекомбинантных ДНК для получения вакцин открыла новые перспективы в разработке синтетических вакцин. Производство последних может заменить имеющиеся бактериальные и вирусные вакцины, часто содержащие посторонние антигенные детерминанты, белки и другие вещества, вызывающие побочные эффекты. Одиберт с сотр. (1981) использовали синтетический антиген дифтерийного токсина для активной иммунизации. Данный токсин представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 62 кД и имеет две дисульфидные связи. Токсичность и иммуногенность белка обусловлены петлей на N-конце молекулы, состоящей из 14 аминокислот, удерживающихся дисульфидным мостиком. Синтетический пептид, связанный с двумя различными носителями, иницировал синтез антител, которые связывались с токсином и предотвращали его дермонекротическое и летальное действие. Формирования иммунитета удалось также добиться при инъекции синтетического пептида белка М Streptococcus pyogenes длиной всего 20 аминокислот. Такие иммуногенные олигопептиды могут составить основу безопасных вакцин против стрептококковых инфекций, которые вызывают ревматизм и связанные с ним поражения сердца.

Дрисман с коллегами (1982) синтезировали два пептида, аналогичные таковым на участке между 117-м и 137-м аминокислотными остатками полипептидной цепи поверхностного антигена вируса гепатита В (цит. по А.Сассон, 1987). Два пептида с последовательностями от 117-й до 137-й и от 122-й до 137-й аминокислоты вводили мышам внутрибрюшинно, используя различные адъюванты. В каждой группе у половины мышей через 7-14 дней после иммунизации были обнаружены антитела против поверхностного антигена вируса. Через три недели у большинства животных титры антител уменьшались.

В Исследовательском институте клиники Скриппса и Институте вирусологии животных (США) синтезированы полипептиды, соответствующие нескольким участкам белка VP1 вируса ящура. В дальнейших исследованиях они обнаружили, что один из полипептидов, включающий участок от 141-й до 160-й аминокислоты VP1, при инъекции с адъювантом и в комплексе с гемоцианином улитки (KLH) иницирует у морских свинок и кроликов синтез антител к вирусу. Причем, титры антител были в несколько раз выше, чем в случае иммунизации животных очищенным белком VP1. Эти животные проявляли устойчивость к последующему заражению (Bittle et al., 1982). Кроме того, преимущество синтетического пептида заключалось и в том, что однократное введение вызывало достаточный иммунный ответ. Данный пептид вызывал образование антител в количестве, достаточном для создания иммунитета у свиней и крупного рогатого скота против ящура. Создание вакцин против ящура на основе синтетических полипептидов могло бы устранить проблемы, возникающие в связи с недостаточной инактивацией вируса и нестабильностью инактивированных вакцин при рН ниже 7 и неблагоприятном температурном режиме внешней среды. Этот подход позволил бы использовать в качестве иммуногенов синтетические пептиды, соответствующие различным серотипам вируса.

Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 вирса ящура. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных вакцин, содержащих домен 142-160 VP1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных вирусов, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего b-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP1 вируса ящура, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия.

И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин: эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда; конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице; изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

В процессе разработки находятся и другие антигены, нацеленные на создание иммунитета против вирусных инфекций. Например, антиидиотипические антитела, получаемые в ответ на иммунизацию противовирусными антителами (Lerner et al., 1985; Dreesman et al., 1985). Антитела, синтезированные против антител, способных узнавать определенные антигенные эпитопы, в свою очередь, сохраняют особенности структуры данных детерминант. Как известно, антиген и антитело соответствуют друг другу как ключ замку. Другими словами, активный центр антитела является как бы слепком детерминанты иммунизирующего антигена. В результате последовательных иммунизаций исходным антигеном, а затем и антителами первого и второго поколений можно получить антитела третьего поколения, по существу повторяющие исходные антитела первого поколения, полученные при иммунизации непосредственно вирусным антигеном. Возможность использования моноклональных антител для получения антиидиотипических антител с “образом” определенных антигенов открывает новые перспективы в конструировании вакцин нового типа. Это особенно важно в борьбе с вирусными инфекциями, возбудителей которых трудно получить в достаточном количестве для разработки вакцин, а также при работе с антигенными эпитопами конформационной природы, для которых невозможно или сложно создавать химические или генно-инженерные вакцины. 

Антиидиотипические вакцины обладают рядом преимуществ перед традиционными профилактическими препаратами. В первую очередь иммуноглобулиновая природа АИАТ исключает возможность реверсии живого аттенуированного микроорганизма в вирулентную форму. Имитация CDR-областью (Complementarity determining region- область, определяющая комплементарность) АИАТ конкретного протективного эпитопа антигена обеспечивает направленную индукцию защитных антител макроорганизма, устраняя синтез антител против слабоиммуногенных и неиммуногенных детерминант микроба или компонентов химических вакцин, что значительно влияет на эффективность иммунизации. Кроме того, как известно, синтетические пептиды, соответствующие участкам первичной аминокислотной последовательности, созданные путем химического синтеза или молекулярного клонирования, не всегда способны поддерживать нативную трехмерную структуру, необходимую для индукции антител нужной специфичности и иммуногенности, что было подтверждено и на модели возбудителя чумы, в отличие от АИАТ, отбираемых именно по конформационной специфичности как «зеркальное отражающих» форму антигенного эпитопа.   

Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин против чумы изучались Федоровым В.А. и Девдариани (2006). Ими получены мышиные АИАТ к белкам Y.pestis c мол. Массой 72, 54, 25 и 87 кД, кодируемым плазмидой вирулентности возбудителя чумы. Для этого мышей линии BALB/с иммунизировали по оригинальной схеме МКА к каждому из антигенов. Комплементарность исходным антигенам была подтверждена с использованием иммунохимического, функционального, иммунологического и иммунобиологического критериев оценки природы «внутреннего образа» соответствующих антител. Все АИАТ реагировали с ксеногенными (кролики, лошади, морские свинки и мыши) сыворотками к исходным антигенам, индуцировали высокий уровень специфических антител с серологическими свойствами, идентичными идиотипическим МКА, демонстрировали выраженную адъювантную активность и были классифицированы как принадлежащие к субтипу АТ2-бета. Наиболее важным свойством АИАТ была способность защищать от экспериментальной чумы не менее 77-80% мышей. Авторы полагают, что АИАТ являются перспективными компонентами при конструировании профилактических препаратов против чумы. Одним из существенных преимуществ антиидиотипических вакцин перед, например, аттенуированными или рекомбинантными живыми вакцинами является возможность их экстренного однонаправленного применения с антибактериальными препаратами при чрезвычайных ситуациях природного, техногенного или биотеррористического характера.          

ДНК-вакцины.Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 10³-10⁴ раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных. 

Плазмидная ДНК представляет собой кольцевую ковалентно-замкнутую молекулу длиной 4-6 тысяч пар нуклеотидов. В ней имеется участок, ответственный за начало транскрипции (промотор), ген протективного белка, ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику (ампициллину), и участок репликации плазмидной ДНК. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена протективного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Плазмидную ДНК реплицируют в клетках кишечной палочки в присутствии ампициллина, очищают и вводят внутримышечно животным в дозе 10 –12 млрд. молекул. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01-1,0%), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой 2 с образованием информационной РНК, которая в цитоплазме обеспечивает синтез протективного белка. Плазмидная ДНК длительное время (до 3-6 мес.) функционирует в клетках. В организме животного плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы, и на нее не образуются антитела. Синтезированный в клетках протективный белок расщепляется в цитоплазматических протеосомах на короткие пептиды (8-10 аминокислот). Последние связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса 1 и транспортируются к клеточной поверхности. Синтезированный протективный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство в свободном нерасщепленном состоянии. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза и расщепляется в эндосомах на короткие фрагменты (10-20 аминокислот). Фрагменты белка объединяются с молекулами ГКГС класса 2 и встраиваются в поверхностную мембрану клетки. На поверхности клетки комплексы антиген +молекулы ГКГС 2 распознаются Т-хелперами. В-лимфоциты под воздействием протективного белка и антигенспецифических активированных Т-хелперов превращаются в антителопродуцирующие клетки.

Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед. после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.

Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В у животных (но не у человека), а также возбудителям микоплазмоза, туберкулеза и сальмонеллеза. В опытах на лабораторных животных показана возможность применения ДНК-вакцинации для защиты от СПИДа и др. Появляются и работы по использованию ДНК-вакцин и в ветеринарии. P.J.Lewis (1997) показали возможность использования векторных плазмид для иммунизации против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, а W.Jiang (1998) – эффективность ДНК-вакцинации при парвовирусной инфекции собак. Протективный иммунитет наблюдали у животных, вакцинированных плазмидой, кодирующей гликопротеин С вируса болезни Ауески (V.Gerdts et al., 1997). Получены результаты по ДНК-вакцинации против вирусной диареи телят ( S.Harpin et al., 1997). Плазмида, кодирующая Hbs-антиген вируса гепатита уток В защищала их от инфекции при заражении (M.Triyatni et al., 1998). 

Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспартат-b-полу-альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd-генерастут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют.

Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения. 

В настоящее время актуальным направлением в разработке генноинженерных вакцин является конструирование различных ДНК-вакцин на базе одного плазмидного вектора. При этом меняют только ген, кодирующий протективный белок. Следует отметить, что ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. В одну плазмидную ДНК можно встраивать гены протективных белков нескольких возбудителей и гены цитокинов – регуляторов иммунного ответа. Проходят экспериментальное изучение ДНК-вакцины, изготовленные из вирусов иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, гепатита В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей туберкулеза и паразитарных заболеваний (малярий и лейшманиоза). Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных. Однако остаются не решенными проблемы безопасности для человека вакцин из плазмидной ДНК. Не определена степень риска мутагенных эффектов и иммунопатологических реакций в ответ на введение ДНК-вакцины. Отсутствуют четкие представления о побочных действиях образовавшихся антигенов и медиаторов иммунного ответа.

 «Векторные» вакцины.В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187т.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилирование мРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина.

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности.