Молекулярно-генетические методы (ДНК – диагностика), их назначение.

Молекулярно-генетические методы.

Основа – генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК.

Объекты – ядросодержащие клетки.

Методики:

Гибридизация ДНК с использованием ДНК-зондов.

Секвенирование – точная последовательность генов (точковые мутации, делеции и инверсии)

Полимеразная цепная реакция . 1993 г. Кэрри Мюмме.

А) Выделение ДНК

Б) Денатурация

В) Амплификация – получение множественных копий участков ДНК

Г) Электрофорез – распределение ДНК в специализированном геле.

Значение:

- определение моногенных мультифакториальных заболеваний.

- восприимчивость человека к инфекционным заболеваням.

- диагностика онкопатологий.

- установление отцовства

- криминалистика.

Применение ферментов-рестриктаз для изучения фрагментов ДНК.

Билет 30.

Близнецовый и биохимический методы изучения наследственности. Сущность этих методов, их этапы и назначение.

Близнецовый метод. Предложен в 1975(уточните)г. Гальтоном.

Суть: изучение генетических закономерностей на близнецах.

Значение: Оценка соотносительной роли наследственности и среды в развитии признака заболевания.

Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки. Они всегда одного пола.

Этапы:

Составление выборки близнецов.

Определение зиготности близнецов на основе конкордантности (процент сходства) и дискондарнтности (процент различия) близнецов по маркерам:

а) пол

б) группа крови, резус-фактор

в) сывороточные белки

г) система лейкоцитарных антигенов (регулируют процессы иммунного ответа, используется в трансплантологии, регуляция процессов эмбриогенеза).

д) полиморфизм ДНК

е) дерматоглифика – рисунки кожи пальцев стоп, ладоней.

3) Формула Хольцингера

Н = (СMZ – CDZ)/(100 – CDZ) * 100%

С – частота встречаемости

Н – коэффициент наследуемости

70% - наследуемость

40-70% - наследственность и среда

<40% - среда

Биохимический метод

Суть: исследование биологической жидкости организма на наличие продуктов обмена веществ (исходных, побочных, конечных).

Объекты: кровь, плазма, моча, пот, культуры клеток (лимфоциты, фибробласты).

Методики:

- качественный тест (реакция Фелинга) – наличие продуктов

- количественный тест (определение концентрации продукта)

- жидкостная и плоскостная хроматография (аминокислоты, олигосахариды, мукополисахариды)

- газовая хроматография (органические кислоты)

- электрофорез (гемоглобинопатия)

- спектроскопия.

Значение:

Диагностика моногенных и мультифакториальных заболеваний (ожирение, сахарный диабет, галактоземия, муковисцидоз, фенилкетонурия).

Определение гетерогенных носителей с помощью нагрузочных тестов (фенилкетонурия).

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия генов (бомбейский феномен).

Изучение клинического полиформизма молекулярных болезней.

Установление времени включения генов в процессе онтогенеза.

Билет 31.

Цитогенетический метод, метод генетики соматических клеток и метод биологического моделирования, их сущность, этапы и назначение.

Цитогенетический метод. Применяют с 1956 г.

Суть: микроскопическое изучение хромосомных комплексов в клетках человека; материалом для кариотипирования служат клетки крови, амниотической жидкости и т.д.

Значение:

Диагностика хромосомных заболеваний.

Пренатальная диагностика хромосомных болезней.

Картирование хромосом

Изучение мутагенного действия факторов окружающей среды.

Определение генетического пола.

Непременным требованием для изучения хромосом является наличие делящихся клеток на стадии метафазы.

Метод определения полового хроматина.

Метод генетики соматических клеток.

Основан на размножении клеток in vitro для изучения генетических особенностей целого организма.

Методики:

Культивирование – позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований.

Клонирование – получение потомков из одной клетки; дает возможность в генетически идентичных клетках (биохимический анализ наследственно обусловленных процессов).

Селекция – отбор мутантных клеток с определенными свойствами и других клеток с интересующими исследователя характеристиками.

Гибридизация – слияние генетического материала клеток разных видов или разных типов позволяет получить клетки с новыми свойствами, позволяют изучить сцепление генов и гибридизацию генов в хромосомах.

Назначение:

Диагностика наслественных болезней на биохимическом уровне путем изучения механизмов первичного действия генов и их взаимодействия.

Точная диагностика наследственных болезней в пренатальном периоде.

Изучение регуляции активности генов.

Генетическое картирование

Изучение мутагенной и канцерогенной активности различных веществ.

Метод биологического моделирования

Основан на законе гомологичных рядов наследственной изменчивости Н.И. Вавилова:

Генетически близкие виды и роды характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости с такой правильностью, что, зная ряд форм в пределах одного вида, можно предвидеть нахождение наследственных форм у других видов и родов.

Этапы:

Подбор биологической модели

Эксперимент

Анализ результатов

Значение:

- изучает патогенез, клинику заболеваний

- методы лечения и профилактики болезней.

Билет 32.

Медико-генетическое консультирование, его цели и задачи. Методы генетики, применяемые в МГК. Методы пренатальной диагностики наследственных болезней.

Для большинства наследственных болезней эффективных способов лечения не существует. Из этого следует, что в борьбе с наследственной патологией основная роль отводится профилактике рождения аномального потомства. В последние десятилетия распространенным и эффективным способом профилактики является медико-генетическое консультирование.

МГК – один из видов специализированной помощи населению, направленной на предупреждение появления в семье детей с наследственной патологией. С этой целью составляют прогноз рождения в данной семье ребенка с наследственной болезнью, родителям объясняют вероятность этого события и оказывают помощь в принятии решения. В случае большой вероятности рождения больного ребенка родителям рекомендуют либо воздержаться от деторождения, либо провести пренатальную диагностику, если она возможна при данном виде патологии.

Этапы:

Уточнение диагноза. Используют генеалогический, цитогенетический, биохимический и другие требуемые методы. Точный клинический и генетический диагноз заболевания позволяет установить степень генетического риска и выбор эффективных методов пренатальной диагностики и профилактического лечения.

Прогноз потомства. Проспективное консультирование – риск рождения больного ребенка определяют до наступления беременности или в ранние ее сроки. Ретроспективное – после рождения больного ребенка относительно здоровья будущих детей.

Риск до 5% - низкий

       до 10% - повышенный в легкой степени

       до 20% - средний (противопоказания к зачатию или показания к прерыванию уже имеющейся беременности).

Принятие решения. Широкое использование МГК, разработка способов пренатальной диагностики наследственных заболеваний позволяет существенно снизить вероятность появления потомства с наследственной патологией в отдельных семьях.

Билет 33.

Определение и основные формы изменчивости в зависимости от реакции генотипа.Наследственная и ненаследственная изменчивость. Формы и примеры ненаследственной изменчивости. Роль биологических и социальных факторов в формировании дефинитивного фенотипа у человека. Понятие о фенокопиях.

Изменчивость – свойство организма изменить свои признаки в ходе онтогенеза. Бывает двух видов:

- групповая (популяция, этносы, расы), пример: пигментация кожи

- индифидуальная - организмы в пределах популяций.

Межгрупповая и внутригрупповая изменчивость обусловлена различиями в генотипе.

Изменчивость:

Ненаследственная. Не происходит изменения генетического аппарата.

А) Модификации

Б) Морфозы и фенокопии

Генотипические изменения:

А) Мутационная

Б) комбинативная

Модификации – фенотипические различия, возникающие на основе одного и того же же генотипа в разных условиях среды.

Спектр модификационной изменчивости ограничившиеся закрепленной генетически нормой реакции.

Норма реакции – диапазон изменчивости в пределах которого один и тот же генотип может давать различные генотипы.

Признаки носят массовый характер, имеют адаптивные значения к изменяющимся условиям среды, часто обратимы.

Генетическая основа – изменение функциональной активности гена.

Степень выраженности признака не выходит за пределы реакции.

Модификации:

Сезонные. Пигментация кожи, уровень витаминов.

Онтогенетические. Рост, масса, зубы.

Экологические. Приспособление к экстремальным условиям. Интенсификация обменных процессов.

Признаки:

С широкой нормой реакции. Рост, моногенность у коров.

С узкой нормой реакции. Размер сердца, разрез и цвет глаз.

С однозначной норме реакции. Группа крови, резус.

Морфозы и фенокопии – уродства и аномалии развития возникают под влиянием экстремальных факторов в критические периоды эмбрионального развития.

Критические периоды:

Образование гамет

Оплодотворение

Имплантация

3-8 неделя – формирование плаценты, закладка осевых органов зародыша.

15-20 неделя – головной мозг

20-24 неделя – половая дифференцировка, развитие основных систем зародыша.

Рождение.

Тератогены

Химические. Лекарства, бензол, фенол, смолы.

Физические. Радиация, гипоксия, механические повреждения.

Биологические. Вирусы (краснуха, грипп, герпес).

Генетическая основа – полное подавление функциональной активности гена.

Признак выходит за пределы нормы реакции.

Фенокопии по фенотипическому проявлению копируют признаки другого генотипа. Чаще всего они копируют хромосомные синдромы.

Пример: умственная отсталость – фенокопия при недостатке иода в рационе беременной женщины или при хромосомных синдромах.

Водянка мозга – следствие радиации или при синдроме Дауна.

Дефинитивные фенокопии – от образования зиготы до полового созревания особи.

Роль биологических и социальных факторов в формировании дефинитивного фенотипа у человека.

Определяя формирование фенотипа организма в процессе его онтогенеза, наследственность и среда могут быть причиной или играть определенную роль в развитии порока и заболевания. Вместе с тем, доля участия генетических и средовых факторов вариьирует при разных состояниях. С этой точки другой формы отклонений от нормального развития принято разделить на 3 основные группы.

Наследственные болезни.

- хромосомные болезни, в основе которых лежат хромосомные и геномные мутации.

- моногенно наследуемые заболевания, обусловленные генетическими мутациями. Примеры: болезнь Дауна, гемофилия, фенилкетонурия.

Мультифакториальные заболевания. Примеры: гипертония, ИБС, язва желудка и двенадцатиперстной кишки.

Причинными факторами их развития являются неблагоприятные воздействия. Реализация этих воздействий зависит от генетической конституции, определяющей предрасположенность организма.

Формы патологии, обусловленные исключительно воздействиями факторов среды. Примеры: травма, ожог, обморожение, особо опасные инфекции.

Билет 34.

Формы наследственной изменчивости, их биологическое и эволюционное значение. Мутации, их классификация (Мушинский, 1972). Значение и примеры у человека. Мутации и морфозы. Понятие о фенокопиях.

К формам наследственной изменчивости относят изменения признаков орг-ма, которые определяются генотипом и сохраняются в ряду поколений:

Комбинативная возникает на основе полового размножения, обеспечивает фенотипическое разнообразие потомства.

Механизмы:

-кроссинговер(рекомбинация генов)

-случайное расхождение Х

-случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения

Имеет положительное значение для эволюции:

-постоянно изменяет признаки

-при взаимодействии неаллельных генов создает новые признаки

-повышает жизнеспособность потомства

-понижает и нейтрализует вредное действие мутаций

Мутационная – обусловлены мутациями генов и Х хромосом, с изменение генотипа. Передаются следующему поколению

Мутагены бывают физические (радиационное излучение), химические (гербициды) и биологические (вирусы).

Основные положения мутационной теории в 1901—1903 годах разработал Гуго де Фриз:

1.    Мутации возникают внезапно, скачкообразно.

2.    В отличие от ненаследственных изменений мутации представляют собой качественные изменения, которые передаются из поколения в поколение.

3.    Мутации проявляются по-разному и могут быть как полезными, так и вредными, как доминантными, так и рецессивными.

4.    Вероятность обнаружения мутаций зависит от числа исследованных особей.

5.    Сходные мутации могут возникать повторно.

6.    Мутации ненаправленны (спонтанны), то есть мутировать может любой участок хромосомы, вызывая изменения как незначительных, так и жизненно важных признаков.

Таким образом, мутации – это внезапное скачкообразное изменение генетического аппарата, передающееся по наследству.

Возникает на любом уровне организации:

1)молекулярно-генетический – генные

2) клеточный- геномные

3)тканевый- соматические , генеративные

3)онтогенетический- морфологические, физиологические, иммунологические, биохимические.

4)популяционно-видовой – нейтральные , полезные , вредные(летальные , полулетальные)

Мутации обуславливают у человека наследственные патологии:

1)Моногенные, молекулярные, генные болезни ( подчиняются закону Менделя)

2)Хромосомные мутации (Болезнь Дауна, синдром Патау, синдром Эдвардса, синдром Тернера)

3)мультифакториальные или с наследственной предрасположенностью.(Псориаз, сах.диабет, шизофрения)

4)соматические мутации ( самопроизвольные аборты)

5)заболевания, связанные с несовместимостью матери и плода по резус фактору( гомолитическая болезнь новорожденных)

6)мутации с невыясненным генетическим эффектом(аходроплазия)

По происхождению:

1)спонтанные

2)индуцированные

Мутация является важнейшим фактором эволюции. Она изменяет гены и их порядок расположения , тем самым увеличивая генетическое разнообразие популяций. Она создает избыточные копии генов , тем самым открывая возможность усложнения организмов.

Морфоз- ненаследственные изменения, вызываемые в соматических клетках организма факторами внешней среды; возникают в результате нарушения действия генов. Типичные М. получают в экспериментальных условиях при действии на развивающийся организм некоторыми химическими веществами (хемоморфозы) или ионизирующей радиацией (радиоморфозы)

Фенокопии- В медицине - ненаследственные болезни, сходные с наследственными. Распространенная причина фенокопий у млекопитающих — действие на беременных тератогенов различной природы, нарушающих эмбриональное развитие плода (генотип его при этом не затрагивается). При фенокопиях изменённый под действием внешних факторов признак копирует признаки другого генотипа (например, у человека приём алкоголя во время беременности приводит к комплексу нарушений, которые до некоторой степени могут копировать симптомы болезни Дауна).

Билет 35.

Генные мутации, их типы и молекулярный механизм. Наследственные болезни человека, обусловленные генными мутациями: гемоглобинопатии и ферментопатии, их молекулярно-генетический механизм. Примеры.

Генные мутации- изменения структуры гена:

1)точковые- затрагивают только 1 нуклеотид.

2)сдвиг рамки считывания : делеция (потеря нуклеотидов) , дупликация ( *2 нулеотидов в гене)

Вставка(включение в цепь нуклеотидов молекулы ДНК дополнительного нуклеотида).

3) замена азотистых оснований:

 -миссенс ( замена 1 смыслового кадона на другой , в белке 1 а.к. заменяется на другую)

-Самиссенс(замена 1 смыслового кадона на другой, кодирующий ту же а.к.)

Механизмы: транзиция А<>Г Т<>Ц , трансверзия А, Г <> Т,Ц

-Нонсенс ( 1 смысл.кодон заменяется на нонсенс кодон > белок не образуется или образуется другой)

Генные мутации обуславливаются у человека наследственными или моногенными заболеваниями:

1)Фенилкетанурия – нарушение обмена веществ

2)гемоглобинопатия

3)коллагеновые дефекты биосинтеза и распада коллагена

Механизм:

Норма- субстрат> промежуточный продукт > конечный

Нарушение – субстрат>промежуточный продукт> побочный

(1)  Фенилкетонурия

Фелинг 1934

Частота (V) 1 на 8000

Нарушение обмена а.к. фенилаланина ( незаменимая а.к. поступает с пищей)

90% связано с нарушением фермента фенилаланингидроксилазы(1.)

Тирозиназа(2.)

Фенилаланин 1.>тирозин 2.> меланин

Поражение цнс , умственная и физическая отсталость.

Галактоземия

Нарушение обмена У-галактозы, источником которой является лактоза молока . Продуктом реакции должна быть глюкоза.

Галактоза и её производная накапливаются в крови и тканях, оказывая токсическое действие на центральную нервную систему, печень и хрусталикглаза, что определяет клинические проявления болезни. Тип наследования галактоземии аутосомно-рецессивный.

Альбинизм

Обусловлен отсутствием синтеза фермента тирозиназы

Муковисцидоз(кистозный фиброз)

Нарушение транспорта ионов хлора и натрия через клеточные мембраны > гиперсекреция слизи >

Кистозные образования. Смерть возникает вследствие сердечной недостаточности.

Биохимические , молекулярно- генетические определения генов.

(2)  Серповидно-клеточная анемия

Мессенс мутация> в бета цепи 6положении гемоглобина глутаминовая кисл. заменяется на валин > серповидные эритроциты

1910- первое выявление

V= 1 на 400

Синдром морфана

Миссенс мутация

V= 1 на 10-15 тыс.

Нарушение синтеза Б фибриллина > растяжение соединительной ткани > паучьи пальцы, искривлённые суставы,

вывих хрусталика , умственная отсталость.

Миопатия дюшена

нонсенс мутация. Поражение мышечной системы в раннем детстве.

Билет №36