Иммунодиагностика бактериальных инфекций

Основы противоинфекционного иммунитета

Иммунитет – это совокупность биологических механизмов, обеспечивающих защиту макроорганизма от генетически чужеродной информации:

· Свои мутационные клетки (10⁶), некоторые злокачественные клетки – иммунологический надзор за постоянством среды.

· Микроорганизмы – противоинфекционный иммунитет.

Классификация противоинфекционного иммунитета:

· Врожденный (видовой, генетический, естественный, неспецифический) – такая невосприимчивость, с которой организм рождается; генетически детерминирован; действуют механизмы, защищающие организм от различных микроорганизмов.

· Приобретенный (специфический) – такая невосприимчивость, которая формируется в процессе развития определенной особи; эффекторы вырабатываются лишь через определенное время после начала агрессии (например, через 7 дней).

Разновидности приобретенного иммунитета:

· Активный (постинфекционный, поствакцинальный).

· Пассивный (постсывороточный, трансплацинтарный – секреторный IgA в молоке матери).

· Гуморальный

· Клеточный

· Антимикробный (антибактериальный)

· Антитоксический

· Противовирусный

· Противогрибковый

· Нестерильный (сохраняется пока микроорганизм в макроорганизме – туберкулез, сифилис).

· Стерильный (сохраняется после выздоровления).

Инфекция

Инфекция (от «infectio» – загрязнение, заражение) – совокупность физиологических и патологических процессов, протекающих в организме при проникновении потенциально патогенных микроорганизмов и развивающихся в определенных условиях внешней среды.

Инфекция = микроорганизм + макроорганизм + внешняя среда

Экспериментальная инфекция

В практической микробиологии большое значение имеет метод воспроизведения экспериментальной инфекции.

Данный метод заключается в заражении животных с целью:

· диагностики инфекционных заболеваний

· изучения вирулентности и токсигенности микробов

· воспроизведения и изучения деталей инфекционного процесса, недоступных при изучении болезни у человека

· испытания лечебного эффекта противоинфекционных химиотерапевтических и иммунологических препаратов

· выделения чистой культуры возбудителя

Существуют различные методы заражения экспериментальных животных:

1. энтеральные

2. парентеральные

· на слизистую глаза

· в дыхательные пути

· накожно

· внутрикожно

· подкожно

· внутримышечно

· внутрибрюшинно

· внутривенно

· в мозг

Заражение может производиться:

· исследуемым патологическим материалом

· чистыми культурами

· пищевыми продуктами

· водой, взвесью почвы

Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний – это частный случай экспериментальной инфекции, осуществляется путем заражения лабораторных животных исследуемым материалом от больного человека с целью:

· оценки клинических симптомов и патоморфологических изменений в организме лабораторных животных (чума, сибирская язва и др.);

· выделения чистой культуры возбудителя (бруцеллез, туляремия и др.);

· постановки реакции нейтрализации токсинов (газовая гангрена, столбняк, ботулизм);

· проведения дифференциальной диагностики заболеваний (туберкулез, возвратные тифы).

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ 11

Иммунодиагностика бактериальных инфекций

Используются серологические реакции – обнаружение неизвестного антигена или антитела по второму известному реагенту in vitro.

Цели серологических реакций.

1. Сероиндикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале, без выделения чистой культуры, с помощью диагностических сывороток. Применяется в экспресс-диагностике, наряду с несерологическими реакциями (ПЦР, ДНК-зондирование, РНТФ).

2. Сероидентификация – обнаружение (идентификация) возбудителя в чистой культуре с помощью диагностических сывороток. Применяется в III этапе бактериологического метода для идентификации чистой культуры по антигенным свойствам.

3. Серодиагностика – обнаружение неизвестных антител в сыворотке крови больного с помощью диагностикумов. Самостоятельный метод диагностики инфекциооных заболеваний – серологический.

Практическое применение серологических реакций.

1. Сероиндикация: РИФ, РПГА, РП (термокольцепреципитации), ИФА.

2. Сероидентификация: РА, РП (в геле).

3. Серодиагностика: РА, РПГА, РСК, нРИФ, ИФА.

Для обнаружения неизвестного антигена в исследуемом материале или в чистой культуре необходимы известные антитела – диагностические сыворотки.

Классификация диагностических сывороток:

1. По способу получения:

· путем иммунизации лабораторных животных;

· моноклональные антитела.

2. По назначению:

· люминесцирующие (флюоресцирующие) – РИФ в сероиндикации;

· суспензионные антитела – РПГА в сероиндикации;

· преципитирующие – РП (термокольцеприципитации) в сероиндикации;

· агглютинирующие (адсорбированные и неадсорбированные) – РА в сероидентификации;

· антитоксические – РП (в геле) в сероидентификации;

· лизирующие – (гемолитическая сыворотка – компонент индикаторной системы в РСК).

Получение диагностических сывороток.

Люминесцирующие сыворотки – получают путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным антигеном, с последующим присоединением к иммуноглобулину люминесцентной (флюоресцентной) метки, например ФИТЦ (флюоресцеина изотиоционат).

Суспензионные антитела – получают путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным антигеном, с последующей адсорбцией иммуноглобулинов Fc-фрагментом на эритроцитах I группы крови человека, предварительно обработанных танином или формалином для улучшения адсорбционных свойств последних.

Преципитирующие сыворотки – получают путем иммунизации лабораторных животных растворимым антигеном.

Антитоксические сыворотки – получают путем иммунизации лабораторных животных анатоксином (анатоксин – экзотоксин, лишенный токсигенных свойств, но сохранивший иммуногенные).

Агглютинирующие сыворотки – получают путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным антигеном. Различают неадсорбированные (содержат полный набор антител) и адсорбированные (удалены ненужные антитела). Ненужные антитела удаляют адсорбцией по Кастелани: иммунизируют лабораторных животных корпускулярным антигеном, с последующим добавлением в полученную сыворотку микроорганизмов, имеющих в структуре антигены, сходные по структуре с теми, на которые наработались ненужные антитела. Т.о. ненужные антитела взаимодействуют с антигенами микроорганизмов и выпадают в осадок.

Лизирующие сыворотки – получают путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным антигеном. Примером является гемолитическая сыворотка – содержит антитела к эритроцитам барана, получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана, является компонентом индикаторной системы РСК.

Для использования большинства иммунологических и серологических методов исследования необходимо иметь стандартные препараты антител. Основные требования к этим препаратам – специфичность, стабильность, достаточное содержание антител. Каждый природный антиген многокомпонентен, и к каждому его эпитопу формируются отдельные клоны антителобразующих клеток, что обуславливает большое разнообразие продуцируемых антител. Более того, к одной антигенной детерминанте может образоваться множество вариантов молекул антител. Т.о., антитела, получаемые от разных особей одного вида, иммунизированных одним антигенным препаратом, не полностью идентичны. Получить абсолютно однородные антитела можно используя клетки – антителпродуценты одного клона – потомков одной специализированной клетки. Решить задачу, используя специально отобранные лимфоциты человека или животного невозможно, т.к. срок жизни каждого клона ограничен и количество антител очень невелико. Положение коренным образом изменилось после того, как Г. Келер и Ц. Милштейн осуществили гибридизацию антителобразующих клеток, полученных от животного с культивируемыми в пробирке клетками злокачественной опухоли – В-клеточной плазмоцитомы. Полученные при этом гибридные клетки обладали свойствами обеих родительских клеток: способностью продуцировать антитела и способностью к неограниченному размножению вне организма. Т.о., были получены теоретически «бессмертные» клоны гибридных клеток (гибридомы), способные к образованию неограниченного количества однородных продуктов одного клона клеток – моноклональные антитела.

Для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больного необходимы известные антигены – диагностикумы. 

Классификация диагностикумов:

1. Бактериальные – во всех реакциях серодиагностики бактериальных инфекций, кроме РПГА.

2. Вирусные – во всех реакциях серодиагностики вирусных инфекций, кроме реакции нейтрализации вируса (РН).

3. Эритроцитарные – только в РПГА в серодиагностике бактериальных и вирусных инфекций.

Получение диагностикумов.

Бактериальный диагностикум – это стандартная взвесь убитых бактерий (искл. живой лептоспирозный диагностикум), реже – отдельные антигены микроорганизмов (О-, Н-, Vi-атигены брюшнотифозных бактерий, гонококковый антиген).

Эритроцитарный диагностикум – это антигены микроорганизмов, адсорбированные на эритроцитах I группы крови человека, предварительно обработанные танином или формалином, для улучшения адсорбционных свойств последних.

Реакции сероиндикации:

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) –проводится с целью сероиндикации бактериальных инфекций. Компонентами реакции являются исследуемый материал и диагностическая сыворотка – люминесцирующая. Ставится на стекле. Учет в люминесцентном микроскопе.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА) – проводится с целью сероиндикации бактериальных инфекций. Компонентами реакции являются исследуемый материал и диагностическая сыворотка – суспензионные антитела. Ставится на стекле. Учет визуальный по выпадению хлопьев.

Реакция преципитации (термокольцепреципитации) – проводится с целью сероиндикации бактериальных инфекций. Используется для диагностики сибирской язвы у животных – реакция Асколи. Компонентами реакции являются термоэкстракт из шерсти животного (исследуемый материал, подготовленный специальным образом – кипятится шерсть животного в физ. растворе, разрушаются термолабильные антигены микроорганизмов, но сохраняется термостабильный соматический О-антиген) и диагностическая сыворотка – преципитирующая. Ставится в узких пробирках. Учет визуальный по кольцу преципитации на границе двух сред.

Реакции сероидентификации:

Реакция агглютинации – проводится с целью сероидентификации чистой культуры в III этапе бактериологического метода (идентификация по антигенным свойствам). Компонентами реакции являются чистая культура (неидентифицированная) и диагностическая сыворотка – агглютинирующая. Ставится на стекле. Учет визуальный по выпадению хлопьев.

Рекция преципитации (в геле) – используется в диагностике дифтерии для определения токсигенности штамма. Компонентами реакции являются чистая культура (идентифицированная) и диагностическая сыворотка – антитоксическая. Ставится в чашках Петри с питательной средой. В центр чашки помещается полоска фильтровальной бумаги, пропитанная антитоксической противодифтерийной сывороткой, а по бокам от нее засеваются чистые культуры. Учет визуальный по образованию усов преципитации рядом с чистой культурой.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ 12

Серодиагностика – это определение неизвестных специфических антител в сыворотке крови больного с помощью заведомо известных антигенов (диагностикумов).

Реакции серодиагностики:

Для серодиагностики применяют РА, РПГА, РСК, нРИФ, ИФА.

Реакция связывания комплемента (РСК). Предложена Ж.Бордэ и О.Жангу в 1901 году. Используется для серодиагностики бактериальных инфекций. Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки с установкой рабочей дозы. В последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплементарность. Постановку основного опыта производят в пробирке путем внесения в нее определенного объема сыворотки крови, антигена (диагностикума) и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Т.о., в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген – антитело, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента с системой антиген – антитело, т.е. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырех крестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко – реакция бактериолиза.

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость – «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия свободного комплемента.

Реакция агглютинации (РА).С целью серодиагностики компонентами РА является исследуемая сыворотка и бактериальный диагностикум. Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения (титрования) исследуемой сыворотки. Для большинства инфекций существует диагностический титр, по которому судят о текущей инфекции. При некоторых заболеваниях необходимо проводить РА с парными сыворотками, т.е. двукратно через временной интервал, для того чтобы увидеть нарастание титра антител в динамике. Ставится в пробирках, в развернутом виде, с учетом диагностического титра. Учет реакции визуальный по выпадению хлопьев.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА). С целью серодиагностики компонентами реакции являются исследуемая сыворотка и эритроцитарный диагностикум. Ставится в планшетах в развернутом виде, с учетом диагностического титра. Учет реакции визуальный («зонтики» - положительная реакция, «пуговки (диски)» - отрицательная реакция).

Существуют реакции, основанные на выявлении взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса по метке одного из участников реакции (РИФ, ИФА).

С целью серодиагностики применяют непрямую реакцию иммунофлюоресценции (нРИФ).Компонентами реакции являются сыворотка больного, диагностикум и меченая флюорохромом (люминофором) антиглобулиновая сыворотка. Учет реакции производится с помощью люминесцентного микроскопа.

Аналогично нРИФ, проводится иммуноферментный анализ (ИФА). Компонентами реакции являются сыворотка больного, диагноситкум и антиглобулиновая сыворотка меченая ферментом. Учет реакции визуальный по изменению окраски соответствующего субстрата.